Notch信号通路在胸腺基质细胞向脂肪细胞转分化过程中的作用及机制研究

发布时间：2020-04-16 23:30

【摘要】：目的:胸腺是机体重要的免疫器官,是孵育T淋巴细胞成熟的场所,来自骨髓的淋巴造血祖细胞(lymphohematopoietic progenitor cell,LPC)经过血液循环进入胸腺,与胸腺微环境相互作用并逐步向成熟的T淋巴细胞发育,最终经胸腺移行到外周的免疫器官并发挥免疫调节功能。胸腺在青春期时重量达到最大,随后便开始发生增龄性萎缩,是机体最早发生衰老的器官,胸腺老化主要表现为明显的萎缩,以腺体变小,重量减低,细胞结构破坏和脂肪细胞的积累为特征。胸腺增龄性萎缩会引起免疫系统衰老和应答免疫系统功能低下,进而导致自身免疫性疾病的发生、增加机体罹患癌症及感染性疾病的危险。近些年的研究表明,许多老年人常见的疾病,如糖尿病、心血管疾病等也可能与胸腺功能减退导致的免疫功能下降相关。胸腺基质细胞是胸腺微环境的主要组成部分,包含胸腺上皮细胞(thymus epithelial cell,TEC)、成纤维细胞、巨噬细胞、树突状细胞(deutrtic cell,DC)等,有研究表明,胸腺内的脂肪细胞主要是由成纤维细胞分化发育而来,然而胸腺内的成纤维细胞向脂肪细胞分化发育的机制却并不清楚。因此研究胸腺脂肪化的分子机制,为进一步探究胸腺的发育和萎缩的分子机制,对提高机体免疫力、延缓免疫系统衰老至关重要。研究方法:1、原代胸腺基质细胞的培养及鉴定:选取出生3天内的小鼠胸腺,利用酶消化方法提取原代的小鼠胸腺基质细胞(thymic stromal cell,TSC),流式细胞术及细胞免疫荧光染色检测细胞的表型。使用过氧化物酶体增殖激活物受体γ(peroxisome proliferators-activated receptorγ,PPARγ)的激动剂罗格列酮,诱导体外培养的TSCs分化成为脂肪细胞,二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)处理的细胞作为对照,油红O染色检测脂滴的形成情况,Real-time PCR检测成脂相关基因PPARγ、FABP4(fatty acid binding protein 4)的mRNA表达水平。2、TSCs向脂肪细胞分化过程中差异表达lncRNA和mRNA的筛选:DMSO组及罗格列酮诱导组各取三组样本,采用高通量测序技术(High-throughput Sequencing),以筛选的阈值为qvalue0.05(若qvalue0.05筛选差异基因过少则使用pvalue0.05进行差异筛选)作为筛选TSCs向脂肪细胞分化过程中差异表达的lncRNA和mRNA标准,并对筛选后差异表达的lncRNA和mRNA进行非监督层次聚类分析、GO分析(gene ontology,GO)和KEGG分析(kyoto encyclopedia of genes and genomes),使用Real-time PCR验证所筛选出的与成脂相关基因的表达变化。3、Notch信号通路在TSCs向脂肪细胞分化过程中的作用:使用Real-time PCR检测在罗格列酮将TSCs诱导分化成为脂肪细胞的过程中Notch信号通路受体(Notch1~4)、配体(DLL1、DLL4、Jagged1、Jagged2)及下游靶基因(Hes1、Hey1)的表达变化,随后过表达或抑制Notch1,油红O染色和Adipored染色观察脂滴的形成,Real-time PCR检测PPARγ、FABP4的mRNA表达水平。4、Notch信号通路与自噬共同调节TSCs的脂肪化:Western blot检测罗格列酮诱导TSCs后0、1、3、5、7天时自噬相关蛋白LC3、p62的蛋白表达水平。Western blot检测不同浓度的Notch信号通路抑制剂DAPT(0、1、2、5、10μm)处理TSCs后自噬相关蛋白LC3、p62及自噬相关通路p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR的蛋白表达水平。在罗格列酮诱导TSCs的过程中同时使用Notch信号通路抑制剂DAPT及自噬抑制剂3-MA,油红O染色和Adipored染色观察脂滴的形成情况,Real-time PCR检测PPARγ、FABP4的mRNA表达水平。结果:1、原代TSCs的提取与鉴定:提取的原代TSCs大多数呈成纤维细胞样,流式细胞术结果显示约97%的细胞呈CD45~-S100A4~+表型,细胞免疫荧光结果也显示多数的细胞呈S100A4~+表型,说明多数的TSCs为成纤维细胞;2、罗格列酮诱导原代TSCs向脂肪细胞分化:分别用DMSO和10μm罗格列酮对TSCs进行处理,(1)油红O染色结果DMSO对照组中并无脂滴形成,而罗格列酮处理组有大量的脂滴出现;(2)Real-time PCR检测脂肪形成相关基因PPARγ与FABP4的mRNA水平,发现罗格列酮诱导组中,两个基因的表达较对照组明显增高;3、筛选TSCs向脂肪细胞转分化过程中差异表达的lncRNA及mRNA:(1)高通量测序一共筛选出1737个差异表达的mRNA(965个上调和772个下调)、45个差异表达的lncRNA(29个上调和16个下调)和31个差异表达的不确定编码潜能的转录本(transcripts of uncertain coding potential,TUCP)(14个上调和17个下调);(2)利用非监督层次聚类的方法对差异表达基因进行分析,分别使用差异表达的lncRNA、TUCP的靶基因和mRNA产生热图,它们清楚地被分离成Rosi和对照簇,同组样本聚在同一簇中;(3)GO显著性富集分析结果显示筛选得到的差异基因无论是mRNA、lncRNA还是TUCP都主要是在细胞代谢、有机物质代谢、氮化合物代谢等过程中显著富集;(4)筛选得到的差异mRNA在PPARγ、胰岛素、环磷酸腺苷(Cyclic Adenosine monophosphate,cAMP)及泛素化介导的蛋白水解相关的信号通路发生显著富集,筛选到的差异lncRNA主要在丝裂原活化蛋白激酶(Mtogen-activated protein kinase,MAPK)、泛素化蛋白水解、过氧化物等信号通路发生显著富集,筛选到的差异TUCP在癌症、神经营养因子等信号通路发生显著富集;4、Notch信号通路在TSCs脂肪化中的作用:(1)Real-time PCR检测结果显示在TSCs向脂肪细胞分化过程中Notch信号通路的受体Notch1、配体Jagged1及靶基因Hey1的表达下降,而配体DLL1的表达升高;(2)构建携带Notch1基因的腺病毒,并转入TSCs中,Western Blot结果显示Notch1过表达后,胞浆内Notch1及胞核内Notch1活化片段N1ICD的蛋白水平表达升高,Real-time PCR结果显示Notch信号通路下游靶基因Hey1的表达升高;(3)对过表达Notch1基因的TSCs进行罗格列酮诱导,油红O染色和AdipoRed染色结果显示脂肪滴的形成受到抑制。Real-time PCR检测结果显示成脂相关基因FABP4的mRNA表达水平出现下降;(4)DAPT和si-Notch1作用于TSCs,胞浆内Notch1及胞核中N1ICD的蛋白水平下降,同时Notch信号通路的下游靶基因Hey1的mRNA水平也出现下降;(5)DAPT和si-Notch1抑制Notch信号通路的同时添加罗格列酮诱导TSCs向脂肪细胞分化,油红O染色和AdipoRed染色结果显示脂肪滴的形成增多,成脂相关因子PPARγ及FABP4的mRNA表达水平在抑制Notch信号通路后表达出现上升;5:Notch信号通路与自噬共同调节TSCs向脂肪细胞分化:(1)分别在罗格列酮处理TSCs后的第0、1、3、5、7天收集细胞并提取蛋白,western blot实验结果显示自噬相关指标LC3、Becline1蛋白水平无明显变化,p62的蛋白表达水平降低;(2)用不同浓度的DAPT(0、1、2、5、10μm)对TSCs进行处理,48h后收集细胞并提取蛋白,western blot实验结果显示自噬相关指标LC3-II/LC3-I随DAPT浓度的增高而呈现逐渐增长的趋势,p62蛋白水平出现了降低,p-AKT/AKT与p-mTOR/mTOR的蛋白表达水平降低;(3)添加自噬的抑制剂3-MA,同时添加或不添加Notch信号通路抑制剂DAPT,油红O染色和AdipoRed染色结果显示使用3-MA抑制自噬后脂肪滴的形成减少,同时还可以部分逆转DAPT导致的脂肪滴形成的增加,在DAPT处理TSCs的同时添加了3-MA,PPARγ及FABP4的表达较单独使用DAPT组下降。结论:1、在罗格列酮诱导的TSCs向脂肪细胞分化过程中有1737个mRNA(965个上调和772个下调)、45个lncRNA(29个上调和16个下调)和31个TUCP(14个上调和17个下调)表达发生明显的改变;2、调节Notch信号通路水平可以影响TSCs向脂肪细胞分化的过程;3、抑制Notch信号通路可通过提高自噬水平来促进TSCs向脂肪细胞的分化。
【图文】：

3.1 原代 TSCs 的提取与鉴定首先，我们根据已有文献报道的酶消化方法进行原代 TSCs 的提取，从细胞形态看，大多数的TSCs呈成纤维细胞样(图3.1A)。S100A4(S100 calcium binding proteinA4)又称 FSP1，是成纤维细胞的特异性标志物，在经过 2 次传代后，我们对所提取的细胞应用流式细胞术进行鉴定，如图所示约 97%的细胞呈 CD45-S100A4+表型(图3.1B)，细胞免疫荧光结果也显示多数的细胞呈 S100A4+表型(图 3.1C)，说明经过传代后，胸腺细胞已被筛除，而剩余的 TSCs 多数为成纤维细胞，我们的结果与之前Yang 等的结果一致

中国医科大学博士学位论文3.2 罗格列酮诱导原代 TSCs 向脂肪细胞分化油红 O 为一种脂溶性的染料，，在脂肪内能高度的溶解，可特异性的使组织或细胞内的甘油三酯着色，是检测脂滴形成的经典实验方法。我们分别用 DMSO 和 10μM 罗格列酮对 TSCs 进行处理，7 天后，利用油红 O 染色检测脂滴形成情况，从图中可以看出，DMSO 对照组中并无脂滴形成，而罗格列酮处理组有大量的脂滴出现(图 3.2A)，同时，我们检测了脂肪形成相关基因 PPARγ 与 FABP4 的 mRNA 水平，发现罗格列酮诱导组中，两个基因的表达明显较 DMSO 处理组高(图 3.2B)。以上结果均说明 TSCs 可以被罗格列酮诱导向脂肪细胞分化。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 张一鸣;谭晓开;王铭远;李呼伦;;调节性B细胞与自身免疫性疾病[J];国际免疫学杂志;2017年02期

2 贾佳;郑凯;;耐受性树突状细胞在自身免疫中的作用[J];国际免疫学杂志;2017年01期

本文编号：2630162