Omentin-1蛋白真核表达及其纯化

发布时间：2020-04-22 04:11

【摘要】：背景:网膜素1(Omentin-1)是一种新型脂肪因子,主要由内脏脂肪组织中间质血管细胞表达。Omentin-1也曾被称为内凝集素1(intelectin-1,ITLN1)、肠乳铁蛋白受体、内皮凝集素HL-1或呋喃半乳糖结合凝集素。研究发现,Omentin-1参与维持机体能量平衡、葡萄糖代谢、心血管保护、抗炎、氧化应激和神经细胞功能调控等生理病理过程,与肥胖症、糖尿病、动脉粥样硬化、心血管疾病、肿瘤和脑梗死等疾病的发生发展密切相关。重组Omentin-1蛋白作为Omentin-1功能验证及探索其在相关疾病中作用机制的重要工具受到研究者们的广泛关注。由于血浆中存在的Omentin-1蛋白为三聚体状态,而目前商品化的Omentin-1蛋白多为原核生物表达,蛋白结构并不能满足这一特性。为最大程度模拟血浆Omentin-1蛋白的生物活性,进一步解析Omentin-1蛋白的生理病理功能,获得Omentin-1三聚体蛋白具有重要意义。目的:建立Omentin-1蛋白真核表达系统,纯化真核表达系统表达的Omentin-1蛋白,并完成纯化Omentin-1蛋白的相对分子质量、纯度及浓度的鉴定。方法:在基础载体pEGFP-N1(4733bp)上构建相对分子质量大小相似的Flag-ITLN1(4905bp)和ITLN1-Flag(4896bp)两种质粒,双酶切实验和DNA测序完成质粒鉴定。以pEGFP-N1质粒转染HEK 293细胞后的荧光强度优化转染条件。Flag-ITLN1(4905bp)和ITLN1-Flag(4896bp)以优化后的转染条件转染HEK 293细胞,并设置pEGFP-N1质粒转染孔评估转染效率,建立Omentin-1真核表达系统。定量逆转录聚合酶链式反应(quantative reverse transcription-PCR,qRT-PCR)检测质粒转染后(24h)HEK 293细胞Omentin-1基因表达量差异,蛋白质印迹法(western blotting,WB)检测质粒转染后(48h)HEK 293细胞培养液中Omentin-1蛋白表达量差异,筛选出Omentin-1蛋白表达量相对较高的Omentin-1蛋白真核表达系统。收集所建立的Omentin-1蛋白真核表达系统的细胞培养液,采用二苯基砜树脂耦连法完成对细胞培养液中Omentin-1蛋白的纯化,分别运用截留分子量为30kDa、100kDa的超滤管分离混杂蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳对纯化的Omentin-1蛋白进行相对分子质量和纯度鉴定,WB及质谱对纯化的Omentin-1蛋白进行定性鉴定,BCA法测定纯化的Omentin-1蛋白浓度。结果:1.Flag-ITLN1质粒转染HEK 293细胞后细胞Omentin-1基因、培养液中Omentin-1蛋白表达量均高于ITLN1-Flag质粒。2.成功建立Flag-ITLN1质粒瞬时转染HEK 293细胞为基础的Omentin-1蛋白真核表达系统。3.成功运用二苯基砜树脂耦连法完成对Omentin-1蛋白真核表达系统所表达的Omentin-1蛋白的纯化。4.纯化后的Omentin-1蛋白相对分子质量约为130kDa,纯度90%,浓度为0.035mg/mL。结论:1.以Flag-ITLN1质粒瞬时转染HEK 293细胞为基础的Omentin-1真核表达系统表达重组Omentin-1蛋白。2.Omentin-1真核表达系统表达重组Omentin-1蛋白为Omentin-1三聚体蛋白。
【学位授予单位】：延安大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R341

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本文编号：2636130