CRISPR-Cas辅助的基因组编辑系统在分枝杆菌中的构建及应用

发布时间：2020-04-22 13:17

【摘要】：结核病(TB)是威胁人类健康的重要传染病。2018年全球结核病报告显示2017年全球范围内估算有1000万结核病新发病例,约有160万例患者死亡;与此同时,耐药结核病仍然是严重危害公共健康的疾病,2017年全球估算新发利福平耐药结核病(Resistant to Rifampicin,RR-TB)患者55.8万例(48.3-63.9万),其中82%为耐多药结核病(Multidrug-Resistant TB,MDR-TB)。而在MDR-TB患者中,估算8.5%为广泛耐药结核病(Extensivelydrug-resistant TB,XDR-TB)。因此,了解结核分枝杆菌的耐药机制,寻找参与耐药的相关基因,进而开发抗结核病新药物对于提高耐多药/广泛耐药结核病的治疗效果显得尤为重要。而目前,对于结核分枝杆菌生物学等基础研究的发展较为缓慢,一方面是结核分枝杆菌代时较长,约为24小时;另一方面受限于缺乏有效的遗传操作系统构建基因敲除突变株和点突变株,获得一个完全突变株的时间大概需要至少半年以上,这严重制约了对于结核分枝杆菌生物学研究。虽然现已有许多基因操作工具成功应用于分枝杆菌中,但都存在着容易使细菌生长受限、构建过程繁琐耗时长以及重组效率低等诸多缺点。CRISPR-Cas系统,包括CRISPR-Cas9系统和CRISPR-Cas12a(Cpf1)系统,具有精确识别及剪切特异性DNA序列的功能而被开发成一种高效便捷的基因编辑工具。在应用中,CRISPR系统可在特定靶点形成DNA双链断裂,继而诱导同源重组(HR)或非同源末端连接修复(NHEJ),为基因组定向改造与调控带来了革命性的突破。本论文旨在以CRISPR-Cas系统为基础开发适用于结核分枝杆菌的基因组编辑工具。论文第一部分将CRISPR-Cas系统,尤其是CRISPR-Cas12a系统与同源重组系统配合使用,即在重组的过程中,构建靶向crRNA引导Cas12a核酸酶对靶点进行剪切产生双链断裂,则可对未发生重组的进行淘汰,从而筛选出发生重组的突变体。首先验证了 CRISPR-Cas12a在耻垢分枝杆菌中具有剪切活性;然后结合同源重组,验证了利用单链DNA寡核苷酸可以有效地进行点突变、删除及插入,随后证实可以双链DNA进行无标签的删除与替换。综上所述CRISPR-Cas系统辅助的同源重组技术在耻垢分枝杆菌中能够快速高效地进行多种基因无标签和无痕突变。本论文的第二部分用CRISPR-Cas系统联合NHEJ,实现了在结核分枝杆菌中进行一步法删除基因。首先将第一部分CRISPR-Cas系统辅助的同源重组技术运用到了海分枝杆菌中,结果并没有发生预期的同源重组而是发生了非同源末端连接的修复。为了进一步推广该系统在其他分枝杆菌中的应用,我们通过三个步骤来增加NHEJ的活性:1)高表达NHEJ元件增加NHEJ修复效率;2)抑制RecA介导的HR,进而增加NHEJ修复效率;3)通过诱导启动表达使CRISPR-Cas介导的DSB断裂发生在菌体生长的稳定期。我们构建了一系列的基因组编辑系统,其中耻垢分枝杆菌需要两步,结核分枝杆菌需要三步才能实现高效的CRISPR-Cas介导的NHEJ进行基因组编辑。与此同时,我们还利用该系统在结核分枝杆菌中实现了精确删除以及同时引入多重突变,实现对结核分枝杆菌基因的高效、快速的遗传操作。此外,鉴于该系统的高效性,可以将该系统用于构建突变子库进行高通量筛选,为深入研究结核分枝杆菌基因的功能,进而了解结核分枝杆菌耐药相关机制提供可靠的技术支持。
【图文】：

逦中国医学科学院北京协和医学院逦博士学位论文逦逡逑ＣＲＩＳＰＲ防御的过程主要包括３个阶段：适应、表达和干扰［１２］。在适应阶段，逡逑ＣＲＩＳＰＲ系统会将一段与质粒或嗤菌体上基因片段（原间隔序歹丨』，ｐｒｏｔｏ－ｓｐａｃｅｒｓ）逡逑同源的短片段ＤＮＡ插入到前导序列与第一段重复序列之间，每一次插入活动都伴逡逑随着重复序列的复制，进而形成一个新的重复序列（Ｒｅｐｅａｔｓ）－间隔序列（Ｓｐａｃｅｒｓ）逡逑单元，这样使得ＣＲＩＳＰＲ基因座中存在着此种质粒或噬菌体的序列信息，为适应性逡逑免疫奠定了结构基础。在表达阶段，ＣＲＩＳＰＲ基因座会被转录成一段长链的逡逑ＣＲＩＳＰＲ邋ＲＮＡ邋（ｃｒＲＮＡ）前体（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ），该前体将会在重复序歹ｉｊ处被剪切，而逡逑后被Ｃａｓ内切酶加工成成熟的ｃｒＲＮＡ。成熟的ｃｒＲＮＡ将会与Ｃａｓ蛋白结合形成逡逑Ｃａｓ／ｃｒＲＮＡ效应复合体，在干扰阶段发挥作用。在千扰阶段，ｃｒＲＮＡ作为复合体逡逑的向导，协助其寻找与其同源的外源核酸靶标，当ｃｒＲＮＡ与原间隔序列互补配对逡逑完成时，，Ｃａｓ核酸酶会对ＤＮＡ进行切割从而对靶标进行降解。逡逑．．．．邋逦

中国医学科学院北京协和医学院逦博士学位论文扰。Ｃｌａｓｓ邋１类ＣＲＩＳＰＲ系统中又包括Ｉ型和ＩＩＩ型两大亚型；Ｃｌａｓｓ邋２类ＣＲＩＳＰＲ中包括与以Ｃａｓ９家族为效应蛋白的ＩＩ型，２０１５年发现的Ｖ型，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓｌ２５］以及作用于ＲＮＡ的ＶＩ型，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓｌ３ａ［１６］。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系统包含一个单一功能Ｃａｓ９和两个非编码ＲＮＡ，即ｃｒＲＮＡ和反式激活ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）邋［１７］。逡逑Ｃａｓ９系统相比，Ｃａｓｌ２ａ有三点不同：一、Ｃａｓｌ２ａ相关的间隔重复序列转录剪成熟的ｃｒＲＮＡ不需要与ｔｒａｃｃｒＲＮＡ结合后再引导Ｃａｓｌ２ａ蛋白对靶标ＤＮＡ进切；二、Ｃａｓｌ２ａ－ｃｒＲＮＡ复合物识别的是一段富含胸腺嘧啶核苷的ＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ邋Ａｄｊａｃｅｎｔ邋Ｍｏｔｉｆ）；而Ｃａｓ９系统识别的是富含鸟Vt呤核苷的ＰＡＭ区；逡逑、Ｃａｓｌ２ａ－ｃｒＲＮＡ复合物剪切ＤＮＡ靶标产生的是一个含有４或５个粘性末端的断裂，而Ｃａｓ９－ＣｒＲＮＡ介导的ＤＮＡ断裂为平末端［１５’邋１８’邋１９］。逡逑
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78;R378.911

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 何子纯;李升锦;;流式细胞术检测胞内重组耻垢分枝杆菌的活力研究[J];中国微生态学杂志;2011年08期

2 吴雯;张红宇;黄汉菊;范兴;罗道泉;吴少庭;;重组耻垢分枝杆菌Msmc~2-CFP10-ESAT6的构建[J];中国病原生物学杂志;2009年03期

3 徐永柱;吕琳;;耻垢分枝杆菌疫苗经灌胃免疫在小鼠体内的分布与安全性研究[J];第三军医大学学报;2009年09期

4 杨春;王渝伟;伊正君;何永林;李娜;徐蕾;张黎;朱道银;;颗粒溶素和白细胞介素12重组耻垢分枝杆菌对小鼠结核病的治疗作用[J];中华结核和呼吸杂志;2007年02期

5 李仲兴;;耻垢分枝杆菌群感染及其菌种鉴定[J];中华检验医学杂志;2006年05期

6 徐苗,陈保文,沈小兵,苏城,罗永艾,王国治;耻垢分枝杆菌作为免疫调节剂的研究[J];中华微生物学和免疫学杂志;2005年09期

7 胡亚文;白嘉诚;葛文雪;姚梦依;张雪莲;;耻垢分枝杆菌中反式翻译报告体系的构建[J];微生物与感染;2019年01期

8 姚建忠,许崇波,刘齐贵,靳风烁;表达人白细胞介素-2重组耻垢分枝杆菌疫苗株的建立[J];第三军医大学学报;2005年07期

9 杨春;徐蕾;伊正君;何永林;李娜;王渝伟;张黎;朱道银;;重组耻垢分枝杆菌对小鼠结核病免疫治疗效果的评价[J];免疫学杂志;2007年04期

10 程继忠,郑波,肖红梁,驹卿,皇甫永穆;结核杆菌HSP70在耻垢分枝杆菌中的表达及其免疫原性研究[J];中华微生物学和免疫学杂志;1998年05期

相关会议论文 前10条

1 甘燕;吴少庭;刘洪波;李俊华;黄达娜;余新炳;;表达SARS病毒M蛋白重组耻垢分枝杆菌疫苗株的建立及其免疫原性分析[A];全国寄生虫学与热带医学学术研讨会论文集[C];2006年

2 陈凌;;重组耻垢分枝杆菌rMS-Ag85a-IL-17a对非特异性哮喘小鼠气道炎症的影响及作用机制[A];第十三届江浙沪儿科学术会议暨2016年浙江省医学会儿科学学术年会论文汇编[C];2016年

3 贾平平;岑山;;异烟肼耐药耻垢分枝杆菌的建立及药物敏感性的测定[A];中华医学会结核病学分会2010年学术年会论文汇编[C];2010年

4 杨春;王渝伟;伊正君;何永林;李娜;徐蕾;朱道银;;GLS／IL-12重组耻垢分枝杆菌对小鼠结核病治疗作用的实验研究[A];2006中国微生物学会第九次全国会员代表大会暨学术年会论文摘要集[C];2006年

5 张震;龙泉鑫;黄谦;谢建平;;耻垢分枝杆菌对TM4噬菌体耐受的机制研究[A];2012年第五届全国微生物遗传学学术研讨会论文摘要集[C];2012年

6 张旭霞;车南颖;李传友;;耻垢分枝杆菌esx-3基因敲除与esat-6/cfp10基因回补[A];《中国防痨杂志》创刊80周年纪念暨学术会议资料汇编[C];2014年

7 黄海荣;Michael McNeil;;结核分枝杆菌基因Rv3806c以及耻垢分枝杆菌mc2155和棒状分枝杆菌中Rv3806c同源基因的功能分析[A];中华医学会结核病学分会2006年学术会议论文汇编[C];2006年

8 何萍;杨杨;宋厚辉;;牛分枝杆菌PE12蛋白在分枝杆菌感染巨噬细胞中作用机制的初步研究[A];中国兽医病理学2017年学术研讨会暨兽医病理学分会第九次全国会员代表大会论文集[C];2017年

9 郭建;范齐文;范小勇;马辉;钱雪琴;胡香南;吴文娟;;结核分枝杆菌rdESAT-6抗原在耻垢分枝杆菌中的制备及其血清学诊断研究[A];第四届中国临床微生物学大会暨微生物学与免疫学论坛论文汇编[C];2013年

10 李俊明;;结核分枝杆菌异柠檬酸裂合酶对分枝杆菌胞内存活的影响及其相关机制研究[A];中华医学会第七次全国检验医学学术会议资料汇编[C];2008年

相关博士学位论文 前10条

1 闫玫漪;CRISPR-Cas辅助的基因组编辑系统在分枝杆菌中的构建及应用[D];北京协和医学院;2019年

2 黄凤;结核分枝杆菌的细胞生长调控机制研究[D];华中农业大学;2012年

3 李启明;结核分枝杆菌耐药基因的鉴定及耐药分子机理的研究[D];西南大学;2018年

4 肖婧;CRISPR干扰系统的建立及其在分枝杆菌重要基因功能研究中的应用[D];北京市结核病胸部肿瘤研究所;2018年

5 史丽滨;耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）EmbC蛋白C端的功能探讨[D];大连医科大学;2005年

6 伊正君;靶向递送GLS/IL-12真核共表达质粒的重组耻垢分枝杆菌治疗性活疫苗的实验研究[D];重庆医科大学;2006年

7 向廷秀;幽门螺杆菌重组耻垢分枝杆菌疫苗的构建及作用机理研究[D];重庆医科大学;2006年

8 杨春;GLS/IL-12重组耻垢分枝杆菌对小鼠结核病的治疗作用[D];重庆医科大学;2007年

9 商正玲;结核Rv1246c-Rv1247c基因重组耻垢分枝杆菌及其编码蛋白功能的初步研究[D];四川大学;2007年

10 刘慧聪;两个TetR家族的转录因子介导耻垢分枝杆菌药物抗性调控的分子机制研究[D];华中农业大学;2016年

相关硕士学位论文 前10条

1 李智颖;Sigma E基因对耻垢分枝杆菌药物敏感性影响及其机制初步探索[D];重庆医科大学;2019年

2 谢霜;LFLIU联合载左氧氟沙星纳米粒对巨噬细胞内耻垢分枝杆菌的杀菌效果研究[D];重庆医科大学;2019年

3 吴蕊鑫;Coronin-1siRNA在巨噬细胞中的特异性表达及抗耻垢分枝杆菌感染的实验研究[D];重庆医科大学;2018年

4 常芳倩;耻垢分枝杆菌整合宿主因子MsIHF的结构与功能研究[D];安徽大学;2019年

5 何黎;细粒棘球绦虫EgM123重组耻垢分枝杆菌构建及其免疫原性研究[D];新疆医科大学;2019年

6 梁思佳;肠道病毒71型疫苗的交叉保护作用及其基因重组耻垢分枝杆菌疫苗的构建[D];桂林医学院;2018年

7 郭殊瑾;耻垢分枝杆菌mc~2155中rpfA基因转录调控机制的研究[D];华中农业大学;2016年

8 梁大航;基于弓形虫ROP18的重组耻垢分枝杆菌的构建及鉴定[D];蚌埠医学院;2013年

9 郑慧敏;低频低强度超声介导质粒转入大肠杆菌及耻垢分枝杆菌的实验研究[D];重庆医科大学;2017年

10 曹俊;耻垢分枝杆菌与结核分枝杆菌抗原的交叉免疫反应研究[D];重庆医科大学;2017年

本文编号：2636559