asb11基因对P19细胞向心肌细胞分化的影响

发布时间：2020-04-28 07:24

【摘要】：在胚胎发育过程中,心脏是最早形成的结构之一。阐明心脏发生过程中心肌细胞分化的基因调控机制对治疗心脏疾病有重要的理论指导意义。ASB11属于ASB家族(全名为含锚蛋白重复序列和细胞因子信号抑制物盒蛋白质家族)。该家族的N端含有锚蛋白重复结构序列,C端具有SOCS盒结构。小鼠asb11基因(m-asb11,Gene ID:NC_000086.7)定位于X染色体上,由9个外显子构成。m-asb11基因的cDNA全长1462 bp,编码323个氨基酸。m-asb11在成体心脏以及成体生殖脂肪垫中大量表达,参与生物体的生长发育以及新陈代谢等多种生命过程。但目前对m-asb11在心脏发育中的作用尚无研究报道。因此,本论文利用P19细胞研究m-asb11基因对P19细胞向心肌细胞分化的影响。P19细胞是从C3H/He小鼠畸胎瘤中分离建立起来的一种胚胎瘤细胞。P19细胞作为一种多能干细胞,具有干细胞分化潜能,也能快速增殖。P19细胞可以在含有0.5%-1.0%浓度的DMSO的培养环境下分化形成心肌细胞,同时在合适浓度的维甲酸的存在下诱导形成神经和神经胶质样细胞。但在DMSO和维甲酸的共同存在下,只会分化成神经和神经胶质细胞。本文首先用小鼠心脏组织提取了总RNA,利用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA,建立了小鼠cDNA文库。以cDNA为模版利用PCR技术扩增出长度为1042 bp的m-asb11基因。进一步将扩增的m-asb11基因片段连接到T-载体上,经Bam HI和XhoI酶切消化,琼脂糖分离获得纯化的m-asb11基因片段,连接到pCMV-Tag2B载体上,构建成m-asb11基因表达质粒。同时,用1.0%DMSO诱导P19细胞向心肌细胞分化,通过RT-PCR、免疫印迹以及细胞免疫荧光对诱导结果进行了检测。RT-PCR结果显示nkx2.5在诱导组有RNA表达。免疫印迹结果显示诱导细胞的心肌特异蛋白肌钙蛋白T(CTNT)以及GATA4蛋白呈从无到有的表达模式。肌球蛋白重链蛋白MF20抗体免疫荧光显示诱导组细胞表达肌球蛋白重链蛋白。这些结果说明模型建立成功。本文进一步利用该心肌细胞分化模型研究m-asb11基因对P19细胞向心肌细胞分化过程的影响。在P19细胞悬浮培养前转染m-asb11基因表达质粒,悬浮诱导4 d后,将诱导后细胞贴壁培养,分别收集培养8 d和13 d的细胞提取总蛋白,采用免疫印迹技术(western blot)进行GATA4和CTNT的蛋白表达分析。免疫印迹分析结果显示,m-asb11过表达组中GATA4和CTNT的表达显著低于诱导组,提示m-asb11可能抑制P19细胞向心肌细胞的分化过程。同时,在培养7 d时取少量细胞爬片贴壁后进行MF20抗体的免疫荧光。免疫荧光结果表明,相较于对照组,m-asb11过表达组的细胞的荧光有所降低。该结果支持m-asb11可能抑制P19细胞向心肌细胞的分化过程的结论。
【图文】：

硕士学位论文非常的保守；而泛素结合酶 E2 一般是分子量较小的蛋白，其活性主要-16 kDa 的核心区域的半胱氨酸残基来维持[5]，泛素结合酶的主要功能是接到泛素连接酶 E3 上去；泛素连接酶 E3 的主要功能是识别底物蛋白接酶 E3 在细胞内有很多种，它通过识别底物蛋白的特异性 motif 来使 E2 并且与底物蛋白结合，它的特异识别底物蛋白的能力赋予了它的选；泛素连接酶在选择底物蛋白时，会借助辅助蛋白来与底物相结合[6]。

图 1-2：P19 细胞诱导心肌分化过程中的基因转录调控网络（引自参考文献[61]）.7 本文研究意义心肌分化的研究在当前的情形下是一个颇具前景的领域,很多心脏疾病都是于心肌细胞形成和分化过程中基因表达的调控网络紊乱造成的[36]。心肌损伤大分都是由于正常的心肌细胞数量减少的原因，但是由于心肌在出生后就会失去殖能力，所以，坏死的心肌会由成纤维细胞形成的疤痕所取代。增加健康的，常收缩的心肌细胞的数量，是心肌损伤的一种有效的治疗方式。心肌细胞移植以有效的增加心肌细胞，所以研究心肌细胞分化和形成过程的基因调控和钙离的信号转导过程是很有必要的。关于 asb11 在神经分化以及骨骼肌分化过程中的作用已有研究[31, 33, 34]。由于SB11 蛋白是在哺乳动物心肌细胞中高表达的蛋白，其是否与心肌分化过程有
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R329.2

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本文编号：2643214