VX-11e抑制Zika病毒复制的机制研究

发布时间：2020-04-29 09:52

【摘要】：研究背景和目的寨卡病毒(ZIKV)是目前几种新兴的虫媒传播病毒之一,1947年首次在乌干达寨卡森林发现,同时也是巴西和波多黎各脑炎和胎儿小头畸形暴发的原因。寨卡病毒可通过伊蚊传播,但与其他蚊媒传播的黄病毒(FVs)不同的是,寨卡病毒具有其独特的特性,即可通过性传播甚至导致持续性传播(1至6个月)。2015年在美洲暴发流行的寨卡病毒已经引发全球公共卫生紧急状况,据预测,在美洲,每年可出现由寨卡病毒引起的400万例临床病例。胎盘和血脑屏障内皮细胞(ECs)通常能阻止母体和胎儿血液的混合,并限制一些物质进入成人和胎儿的神经细胞室。而寨卡病毒则是可以穿过这些细胞,进而感染胎儿和母体。所感染的细胞包括神经干细胞、星形胶质细胞、神经祖细胞、小胶质细胞和Hofbauer细胞。据报道,系统进化树分析发现,同样能在人和蚊子中共同传播的登革病毒(DENVs)与寨卡病毒具有惊人的同源性。目前仍不清楚引发最近暴发流行和严重疾病的原因,迫切需要实验系统来解决这些关键的科学问题。新近研究发现寨卡病毒感染与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路存在一定的联系,而且MAPK-ERK信号通路目前仍然是目前的研究热点。因此本课题主要研究ERK2抑制剂VX-11e抑制寨卡病毒的复制、增殖的机制。从而为临床寨卡病毒病的药物治疗研究提供新的思路。研究方法1.VX-11e对寨卡病毒复制的影响寨卡病毒在Vero细胞中扩增和滴度测定后,感染HBMEC和Vero细胞。不同浓度的VX-11e作用于感染病毒的细胞后,应用实时荧光定量PCR(Real-Time PCR,qPCR)等技术分别检测病毒在细胞内的复制情况,以及相对应的细胞外调节蛋白激酶(ERK)和核糖体S6蛋白激酶(RSK)的表达量,确定VX-1 1e对寨卡病毒复制的影响。2.RSK对寨卡病毒复制的影响运用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术对RSK和ERK进行沉默后,检测RSK和ERK的表达量,确证沉默相应基因后RSK和ERK表达量减少。应用qPCR技术对寨卡病毒的复制增殖量进行检测,明确病毒复制与RSK和ERK表达量之间的关系。3.寨卡病毒NS5蛋白表达载体的构建运用真核表达载体pEGFP-N1构建寨卡病毒NS5蛋白表达载体。结果(1)寨卡病毒可以在HBMEC中扩增,与新近的报道结果一致。尤其是ZIKV可以感染HBMEC,为ZIKV导致神经系统感染解释了跨越血脑屏障的途径。(2)VX-11e在一定浓度范围内对FHBMEC和Vero细胞无明显毒性,对寨卡病毒具有明显的抑制增殖的作用,具有浓度依赖性。这种抑制作用不影响病毒对细胞的粘附,主要是通过抑制病毒在细胞内的复制作用。(3)VX-1 1e在mRNA和蛋白质水平上具有抑制RSK表达的作用。(4)初步实验结果提示抑制RSK的表达对病毒的复制具有抑制作用。(5)成功构建pEGFP-NS5蛋白表达载体。(6)VX-11e对寨卡病毒全长克隆Z0E2-GFP转染后产生的寨卡病毒有抑制作用,而突变后Z0E2-mute不表达NS5蛋白,VX-11e对其抑制效果消失,重新加入pEGFP-NS5表达载体表达NS5蛋白后,抑制效果恢复。结论VX-11e通过抑制细胞内RSK的表达,进而影响寨卡病毒NS5蛋白,最终达到抑制寨卡病毒在细胞中复制的作用。通过本文的研究,为临床寨卡病毒病的药物治疗研究提供新的思路线索。
【图文】：

用自：Ａｎｊｕｍ邋Ｒ，Ｂｌｅｎｉｓ邋Ｊ邋（２００８）邋Ｔｈｅ邋ＲＳＫ邋ｆａｍｉｌｙ邋ｏｆ邋ｋｉｎａｓｅｓ：邋ｅｍｅｒｇｉｎｇ邋ｒｏｌｅｓ邋ｉｎ邋ｃｅｌｌｕｌａｒ邋ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ．邋Ｎａｔ邋Ｒｅｖ邋Ｍｏｌ邋Ｃｅｌｌ邋Ｂｉｏｌ）逡逑ＲＳＫ的结构是复杂的并且包含两个功能不同的激酶结构域，接头区，以及逡逑Ｎ－和Ｃ－末端尾（图１）。ＮＴＫＤ与ＡＧＣ家族的激酶（ＰＫＡ，ＰＫＧ，邋ＰＫＣ）具有逡逑同源性。Ｃ末端激酶结构域（ＣＴＫＤ）与钙／妈调蛋白依赖性蛋白激酶（ＣａＭＫ）逡逑同源。ＣＴＫＤ参与ＲＳＫ的自身磷酸化，ＮＴＫＤ负责底物磷酸化［２６，气激酶结构逡逑域通过保守的接头区域连接。称为Ｄ结构域的ＥＲＫ对接基序存在于Ｃ－末端尾逡逑部。ＲＳＫ与ＥＲＫ１邋／邋２的相互作用通过Ｄ结构域中的特定基序（Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｎ－逡逑ＡｒｇＡｒｇ）发生［４Ｇ］。Ｘ．ｌａｅｖｉｓ研究了邋ＥＲＫ和ＲＳＫ相互作用的功能关系，其中逡逑ＲＳＫ与无活性的ＥＲＫ相关；在卵母细胞成熟过程中激活ＥＲＫ后，ＲＳＫ与ＥＲＫ逡逑解离［４１］。在哺乳动物细胞中，ＲＳＫ１通过位于Ｄ结构域附近的Ｓｅｒ残基的自磷逡逑酸化从ＥＲＫ１／２解离

Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｔｏｘｉｃｉｔｙ邋ｏｆ邋ＶＸ－ｌｌｅ邋ｔｏ邋ＨＢＭＥＣｓ邋ａｎｄ邋Ｖｅｒｏ邋ｃｅｌｌｓ逡逑１．４．２不同浓度的ＶＸ－ｌｌｅ作用于感染寨卡病毒的ＨＢＭＥＣ和Ｖｅｒｏ细胞逡逑如图１－２至图１－４所示，当ＶＸ－ｌｌｅ在ＨＢＭＥＣ和Ｖｅｒｏ细胞中分别以０－２０逡逑ｐＭ邋和邋０－１５邋ｎＭ邋浓度作用于细胞时［ＨＢＭＥＣ：邋０逦（１±０．０３），５邋ｐＭ逡逑（０．９８２±０．１１１）邋，邋１０邋＼ｉＭ邋（０．６９３±０．２２１）邋，邋１５邋ｐＭ邋（０．０１１邋±０．００７邋），２０逡逑（０．００１４±０．０００９５）；邋Ｖｅｒｏ邋细胞：０邋ｎＭ邋（１±０．０４５），５邋ｊｉＭ邋（０．５０２±０．１２３），１０逡逑ｐＭ邋（０．１７３±０．０７１），，１５邋ｐＭ邋（０．０４２±０．０１）］明显抑制了寨卡病毒的复制，且这逡逑种抑制作用具有浓度依赖性（趋势性检验，Ｐ＜０．０５）。但从结果中可看出，相同逡逑浓度分别作用于ＨＢＭＥＣ和Ｖｅｒｏ细胞时，起到的抑制效果不完全相同。在逡逑ＨＢＭＥＣ中，ＶＸ－ｌｌｅ浓度为５邋ｐＭ时，寨卡病毒ｍＲＮＡ的相对表达量减少了逡逑２２．２％；而在Ｖｅｒｏ细胞中
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R373

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本文编号：2644448