小分子化合物诱导体细胞重编程荧光蛋白追踪细胞系建立及鉴定分析

发布时间：2020-05-15 15:35

【摘要】：背景:体细胞重编程技术极大地促进了再生医学研究的发展,包括核移植和细胞融合,还有获得2012年诺贝尔奖的病毒载体介导的转录因子诱导重编程等方式,但是这些诱导方式存在着各种技术问题与潜在的安全问题,如操作方法复杂,诱导效率低,外源基因插入以及病毒重新激活等,这些都严重限制了体细胞重编程技术的进一步发展与应用。与上述体细胞重编程方法相比,小分子化合物诱导体细胞重编程拥有诸多优势,如原料容易合成与储备,作用可逆,诱导可以标准化控制,应用更为安全等。小分子化合物诱导获得的多能性干细胞(Chemically induced pluripotent stem cells,CiPS)可以避免病毒及转录因子给细胞带来的安全问题,更有利于走向临床的应用。目的:基于前期我们已经成功开发了一种操作简便、诱导过程条件均匀、所有成分明确、标准化的小分子化合物诱导方法,验证重编程起始细胞确为小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblasts,MEFs),进一步研究小分子化合物重编程机制。方法:本研究使用转基因小鼠构建FSP-tdTomato荧光蛋白追踪的成纤维细胞进行小分子化合物诱导重编程,获取了FSP-tdTomato的CiPS细胞系,并通过形态学分析,多能性基因mRNA、蛋白质的表达情况以及畸胎瘤实验等对其多能性进行鉴定。结果:本实验结果表明,小分子化合物处理tdTomato-MEFs 40天之后,出现核仁明显、核质比高、细胞呈圆形、团块状聚集的细胞克隆,并且高表达多能性基因,体内可分化为三个胚层组织。结论:以上结果表明tdTomato-MEFs可用于小分子化合物重编程为CiPSCs,并且具有与小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)类似的多能性。该荧光蛋白追踪细胞系的建立将有利于小分子化合物重编程机制的进一步研究,并且该细胞系的进一步分化仍能保持荧光蛋白持续表达,可用于CiPSCs来源功能性细胞的移植追踪等研究。
【图文】：

华南理工大学硕士学位论文。若有肿瘤形成，将其剥离后用 4%多聚甲醛固定，送至广州生物医药与理实验室进行石蜡切片和 H&E 染色。嵌合体小鼠检测鼠嵌合体是来源于两个或两个以上胚胎或个体的个体。1961 年，A.Tarkow胚胎的透明带去除，聚集形成嵌合体，成功地制作了世界上第一只嵌合体，Garder 将囊胚细胞注射到囊胚腔，创建了囊胚注射法制作嵌合体。小鼠应用于研究胚胎和器官发育问题，分析复杂表型，传递 ES 细胞基因组（，获得基因突变小鼠，或者判断细胞系多能性和发育潜能。本实验主要用多能性和发育潜能。技术流程如下：

图 2-2 小鼠阴道栓实体图鼠称重后按 40-50 mg/kg 戊巴比妥钠 75%酒精喷消毒小鼠腹部，再用棉球 1 cm 的横切口，再在腹壁做一个同子轻轻夹住左侧睾丸的脂肪垫并将其管在睾丸的下面，，有血管伴行，用烧心送回腹腔，重复以上步骤夹断右侧。缝合小鼠腹壁和皮肤。将小鼠放入公鼠与母鼠合笼检测公鼠是否结扎成用结扎雄鼠与雌鼠交配，尽管雌鼠处于胚胎移植的接收转态，而且假孕导产生用于囊胚子宫胚胎移植的假孕
【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R329.2

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本文编号：2665259