过表达和干扰PGC-1α对PD动物模型中小胶质细胞的影响

发布时间：2020-05-16 11:31

【摘要】：帕金森病(Parkinson disease,PD)又称震颤性麻痹,是神经退行性疾病,在世界范围内随年龄的增加发病率大幅增加。其致病机理是中脑黑质路易小体的堆积和多巴胺能神经元的丢失以及纹状体内多巴胺含量的减少造成的黑质—纹状体通路递质的不平衡而形成的多种功能障碍。遗传易感性、炎症、环境因素、重金属因素、头部创伤以及细菌或者病毒的感染等均可导致多巴胺能神经元的凋亡而发生PD。研究已证实炎症反应在PD的发生发展过程中起着重要作用,并且在疾病早期就已出现,慢性炎症导致黑质纹状体通路受损。在生理条件下,小胶质细胞表现出静息表型,时刻监测其周边环境。当小胶质细胞检测到损害CNS稳态的“危险”信号时,迅速活化。活化的小胶质细胞呈现巨噬细胞样的阿米巴状,释放大量促炎细胞因子和活性氧等神经毒性物质,导致多巴胺能神经元凋亡。受损的多巴胺能神经元反过来作为刺激因素进一步刺激小胶质细胞的活化,形成一个恶性循环的病理过程,导致神经退行性病变的持续发展。近年来发现,与线粒体的生物发生密切相关的过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)的共激活因子1α(PGC-1α)具有显著的细胞保护作用。本课题组前期研究结果显示,通过携带有PGC-1α基因的慢病毒转染SH-SY5Y细胞,使其PGC-1α过表达能显著抑制线粒体自噬,并提高MPP~+损伤的SH-SY5Y细胞的存活;立体定位注射过表达慢病毒于小鼠的黑质后,腹腔注射MPTP复制PD模型,发现多巴胺能神经元细胞数量增加,但无统计学差异,而且小胶质细胞激活显著高于MPTP实验模型组。因此,我们推测PGC-1α的过表达对多巴胺能神经元的这一保护作用,除了直接对神经元本身的作用外,可能与激活小胶质细胞有关。本论文拟探讨PGC-1α表达量的变化对炎症反应中小胶质细胞极化的影响,以及小胶质细胞的极化与PD发生的关系,为揭示PD发生的机制和PGC-1α的神经保护作用提供基础研究资料。本研究以C57BL/6小鼠作为实验对象,立体定位注射构建的过表达和干扰PGC-1α慢病毒至小鼠的黑质,饲养到29 d,以腹腔注射MPTP的方式复制PD小鼠亚急性模型。采用行为学方法检测小鼠的PD症状,Western blot检测TH、PGC-1α、IL-6蛋白在黑质内的表达情况,ELISA方法检测血液中IL-6、IL-1β的含量变化,免疫荧光方法检测TH、PGC-1α等阳性细胞在黑质内的数量变化和小胶质细胞的标记物Iba1(ionized calcium-binding adapter molecule 1,Iba1)以及M1型标记物iNOS(inducible nitric oxide synthase,iNOS)与M2型小胶质细胞标记物Arg1(Arginase catalyzes 1,Arg1)在数量上的变化。通过对检测数据的统计,得到如下结果:1.MPTP组小鼠的黑质内,Iba1标记的小胶质细胞数目和Iba1/PGC-1α双标细胞数目显著多于control组(P0.05)。在注射慢病毒的PGC-1α过表达及干扰组小鼠黑质内,确认其小胶质细胞细胞被慢病毒所转染。2.在PGC-1α过表达实验中,MPTP+LV-PGC-1α组与MPTP组比较,转棒掉落次数显著减少(P0.05)、潜伏期显著增长(P0.05);免疫荧光结果显示,MPTP+LV-PGC-1α组较比MPTP组,黑质内小胶质细胞数量显著增加(P0.05);MPTP+LV-PGC-1α组小鼠的黑质内PGC-1α的蛋白表达量较比MPTP组和LV-EGFP组显著升高(P0.05),血液中IL-1β的含量显著增加(P0.05);MPTP+LV-PGC-1α组较比MPTP组,其TH表达量升高,但无显著性差异(P0.05)。3.在PGC-1α干扰实验中,MPTP+LV-shRNA-PGC-1α组较比MPTP+LV-shRNA-EGFP组,小鼠的站立次数显著减少(P0.05);MPTP+LV-shRNA-PGC-1α组与MPTP组及LV-shRNA-EGFP组比较,黑质内PGC-1α的蛋白表达量显著降低(P0.05),iNOS阳性细胞数显著降低(P0.05);MPTP+LV-shRNA-PGC-1α组与MPTP组相比较,血液中IL-6的含量显著下降(P0.05);MPTP+LV-shRNA-PGC-1α组与MPTP组相比较,Arg1细胞数减少且有显著差异(P0.05)。4.米诺环素联合PGC-1α过表达实验中,MPTP+LV-PGC-1α+Mino组与MPTP+LV-PGC-1α组比较,小鼠中脑黑质致密部区域的TH阳性神经元显著增加(P0.05),黑质部位Iba1细胞激活数目显著减少(P0.05),小鼠中脑黑质致密部区域的iNOS细胞数目显著减少(P0.05)。通过对上述结果的分析,得出如下结论:1.提高PD小鼠黑质内PGC-1α的表达量,能激活小胶质细胞,由M1型小胶质细胞释放的炎症因子增加;能部分地显著改善PD小鼠的运动症状。2.降低PD小鼠黑质内PGC-1α的表达量,能显著降低PD小鼠的自主活动,M1和M2型小胶质细胞数量均显著减少,M1型小胶质细胞释放的炎症因子的量显著降低。3.抗炎药物—米诺环素能显著降低因PGC-1α过表达引起的黑质小胶质细胞激活,多巴胺能神经元数量显著增加。从上述结果和结论中可看出,黑质PGC-1α过表达确实能激活小胶质细胞,但未出现作者希望的抗炎的M2型小胶质细胞的增加,而是促炎的M1型释放的炎性因子增加了,炎症反应加强。从行为学和形态学检测的结果看,提高黑质PGC-1α的表达能显著改善PD小鼠部分运动症状,对多巴胺能神经元有保护作用。这似乎提示PGC-1α的神经保护作用不是通过增加M2型小胶质细胞的数量和功能实现的,而是提升了多巴胺能神经元自身的抗MPP~+损伤能力所导致。但鉴于被激活而增加的小胶质细胞其分化时程的复杂性,本实验的取材时间点可能早于或晚于M1向M2型分化的时间,所以上述结论尚需进一步实验进行验证。本研究为提升PGC-1α的表达防治PD提供了部分基础资料,但相关的机制还有待于后续的进一步研究。
【图文】：

流程图,模型建立,流程图,小鼠

TP（30 mg/kg）。(1) PD 动物模型的复制参考《The Mouse Brian in Stereotaxic Coordinates》，确定注射位点，对一月龄小鼠（约-18 g）进行黑质立体定位注射。腹腔注射 10%的水合氯醛（大约 0.06-0.08ml），麻醉小鼠。等待大概 5min，掐小鼠尾待小鼠无反应后固定小鼠于立体定位仪上。首先减去头部的毛，再用蘸有酒精（75%）棉球擦头部，，然后剪开头皮大概 0.3cm 左右，用棉球将内脑膜擦掉，参考《The Mouse BrianStereotaxic Coordinates》，明确注射位点：Bregma 后 3 mm、旁开 1.3 mm、深 4.5 mm。到注射点并标记，保持颅骨钻平稳准确的钻开注射点的头骨后，插入微量进样器。插入程要缓慢（1min 左右），待整个进样系统稳定后，开始匀速注射，时间为 30 min。saline射完后，继续等 15 min，小心别让脑内注射物倒流，缓慢匀速抽出，然后缝合头皮。继饲养小鼠于恒温恒湿条件至 29 天进行腹腔注射 MPTP/saline，持续 3 d。具体的时间表如。

黑质,标尺,星形胶质细胞,网状部

结果如图 2、3 显示，空白对照组中小胶质细胞和星形胶质细胞表达较少且呈状态；MPTP 组中小胶质细胞明显激活且数目增多，有些 Iba1 标记的小胶质细胞呈现细胞样，分布于黑质致密部和网状部；GFAP 标记的星形胶质细胞同样表现激活现象质致密部和网状部 GFAP 荧光强度增加。小胶质细胞和星形胶质细胞细胞核与 PGC-标，且 PGC-1α/Iba1 双标细胞数较空白对照组显著增多（P<0.05）。
【学位授予单位】：河北师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R742.5;R-332

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