MDA5及RNA解旋酶A参与细胞应激反应的作用研究

发布时间：2017-03-25 07:06

  本文关键词：MDA5及RNA解旋酶A参与细胞应激反应的作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：细胞为了应对外界多种多样的的刺激(诸如病毒感染,热刺激,氧化刺激,内质网应激,紫外线照射等),演化出了许多应对这些刺激的机制。这些机制主要包括:固有免疫,应激颗粒(Stress Granule,SG)的形成以及自噬的发生等。固有免疫作为一个经典的应激机制,其主要是通过一些固有的模式识别受体识别外来的侵入者,并激活下游的效应通路。例如病毒感染就是主要被细胞膜上的Toll样受体(Membrane-bound Toll-like receptors,TLRs)以及细胞内的RIG-I样受体(RIG-I-like receptors,RLRs)识别。其中RIG-I样受体家族包括两个主要的识别受体:视黄酸诱导基因-I(Retinoic acid-inducible gene-I,RIG-I)和黑色素瘤分化基因5(Melanoma differentiation-associated gene 5,MDA5)。应激颗粒形成是细胞应对外界刺激的另一个应激机制。静息的细胞中,胞内m RNA通过一系列的调控维持自身的稳定、定位并完成翻译的过程。而当细胞的翻译过程在外界压力的干扰下停止后,停止翻译的m RNA会被募集入胞质中的颗粒复合物中(例如SG)以保护其不被细胞内的酶所水解。自噬是细胞进化过程中高度保守的一个细胞应激机制,其通过降解细胞内受损的细胞器和错误折叠的蛋白来维持细胞内平衡。自噬的过程主要是通过自噬体将待降解的物质包裹起来后,与细胞中的溶酶体相结合,随后这些物质即会被溶酶体内的水解酶所降解。本实验室前期证明RNA解旋酶A(RNA helicase A,RHA)与SG起始因子蛋白激酶R(protein kinase R,PKR)发生相互作用;并发现固有免疫蛋白IFN-β启动刺激因子-1(innate immune adaptor IFN-βpromoter stimulator,IPS-1)参与ds RNA诱导形成SG的过程,表明细胞内不同应激机制之间存在着一定的联系。为了进一步研究探讨SG形成与固有免疫、自噬的发生之间的关系,本研究利用一个氧化应激刺激物羰基氰化间氯苯腙(carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone,CCCP)进行了细胞刺激实验,检测分析了固有免疫蛋白在其中的调控机制;最后,我们通过进一步确定了RHA与PKR相互作用在细胞SG形成中的作用机制。第一部分MDA5对CCCP诱导的自噬和应激颗粒的调控的研究研究目的:通过使用CCCP刺激细胞,探索不同免疫蛋白对其诱导的SG的影响,进一步研究SG形成与固有免疫的关系;同时,检测这些免疫蛋白是否对CCCP诱导的自噬有影响。研究内容:1.通过si RNA(si PKR,si IPS-1,si RIG-I,si MDA5)在A549和He La细胞中沉默相应的蛋白,Western blotting检测si RNA的沉默水平;使用CCCP刺激细胞,免疫荧光(IF)检测经TIA-1,G3BP1和TIAR染色的SG的细胞百分率。2.使用CCCP分别刺激MDA5沉默的A549和He La细胞,Western blotting检测e IF2α的磷酸化水平。3.分别使用CCCP,poly(I:C),hippuristanol和热激刺激细胞,IF检测TIA-1或G3BP1和MDA5的共染色情况。4.使用CCCP,雷帕霉素和饥饿分别刺激沉默或未沉默MDA5的细胞,Western blotting和IF检测细胞中LC3-I和LC3-II的水平;雷帕霉素和饥饿处理组作为对照。5.通过si RNA沉默细胞中的G3BP1后,使用CCCP刺激细胞A549和He La细胞,Western blotting和IF检测细胞中LC3的水平。研究结果:1.WB结果显示si RNA可有效沉默细胞中的靶蛋白水平,IF结果显示si MDA5-1和si MDA5-2以及si MDA-mix能够降低MDA5蛋白的表达。MDA5沉默细胞中SG阳性细胞百分比明显低于转染了si NC组的细胞,而沉默了RIG-I,PKR,IPS-1的细胞,SG阳性细胞百分比并没有发生明显的变化。2.CCCP刺激可引起e IF2α的磷酸化;而MDA5沉默的细胞中,磷酸化水平与对照组相比并没有发生明显的变化。3.在CCCP,poly(I:C),hippuristanol和热激刺激后,细胞里出现TIA-1和G3BP1形成细胞质颗粒;但MDA5蛋白并没有形成颗粒。4.与对照组相比,受到CCCP,雷帕霉素和饥饿刺激的细胞的LC3-II/actin的比率明显升高。而当MDA5沉默后,CCCP组升高的LC3-II/actin比率发生了明显的下调,这种下调并没有出现在雷帕霉素和饥饿刺激的细胞组内。5.转染了si G3BP1的细胞中LC3-II/actin的比率明显低于对照细胞。结论:1.MDA5在CCCP诱导SG的形成过程中有着重要的作用。2.MDA5并没有影响e IF2α的磷酸化,其调控SG形成的位点位于e IF2α的下游通路中。3.MDA5并不是CCCP诱导的SG组成成分。4.MDA5参与了CCCP诱导的自噬过程。5.CCCP诱导的自噬可能依赖于SG的形成。综上所诉,本研究发现了固有免疫蛋白MDA5参与CCCP诱导SG和细胞自噬的过程,为证明细胞不同应激过程存在着联系提供了证据。第二部分RHA参与细胞颗粒形成的研究研究目的:使用免疫荧光的方法,进一步分析RHA与PKR相互作用的结构域;确定RHA,PKR和SG三者之间的相互关系,阐明RHA与PKR相互作用的模式和影响因素。研究内容:1.通过免疫荧光检测poly(I:C)刺激诱导情况下,RHA与PKR的细胞定位情况。2.分别克隆带有GFP标签的RHA N端、解链酶核心区以及C端的分段克隆(RHAN-GFP、RHAM-GFP和RHAC-GFP)和带有m Cherry标签的PKR N端及C端的克隆(m Cherry-PKRN和m Cherry-PKRC)分别转染A549细胞,poly(I:C)处理检测其进入SG的区段。3.将带有GFP标签的RHA N端和带有m Cherry标签的PKR N端共转染入细胞,使用poly(I:C)处理,检测其共定位情况。4.通过免疫荧光检测poly(I:C)刺激诱导情况下,RHA和PKR分别与SG的两个组分TIA-1和G3BP1的共定位情况。5.通过si RNA沉默细胞中的PKR,RHA后,poly(I:C)刺激细胞,免疫荧光检测胞内PKR,RHA,TIA-1,G3BP1颗粒的形成情况。研究结果:1.在poly(I:C)刺激的细胞中,RHA和PKR在胞质内形成了颗粒,并聚集在一起。2.在poly(I:C)刺激的细胞中,带有标签的RHA N端和PKR N端均能在细胞中形成颗粒。3.在poly(I:C)刺激的细胞中,带有标签的RHA N端和PKR N端形成的颗粒在胞质内共定位。4.在poly(I:C)刺激的细胞中,RHA和PKR与TIA-1均能全部共定位,而与G3BP1只能部分或不共定位。5.在沉默了PKR的细胞中,TIA-1,RHA和G3BP1形成的颗粒明显下降;而沉默RHA的细胞中,只有TIA-1形成的颗粒明显下降。结论:1.在ds RNA刺激的情况下,RHA与PKR能够明显的共定位。2.RHA N端和PKR N端在其形成颗粒及相互作用的过程中起着主要的作用。3.RHA,PKR和TIA-1在poly(I:C)刺激的细胞中形成的颗粒可能并不是经典的SG。4.RHA,PKR和TIA-1的相互作用可能对于细胞有着其他重要的作用。综上所述,本研究进一步证实了RHA和PKR的相互作用,同时发现了其相互作用可能不仅仅局限于与SG的形成有关,还可能与细胞其他的生理机制有关。
【关键词】：MDA5 CCCP SG 自噬 RHA
【学位授予单位】：中山大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要3-7
• Abstract7-13
• 前言13-17
• 材料与方法17-24
• 1 实验材料17-21
• 2 实验方法21-24
• 实验结果24-42
• 一、MDA5对CCCP诱导的自噬和应激颗粒的调控的研究24-33
• 1 MDA5的沉默减弱CCCP诱导形成的SG24-26
• 2 MDA5在eIF2α 的下游调控CCCP诱导形成SG26-27
• 3 MDA5不是CCCP诱导的SG的组成成分27-28
• 4 MDA5的沉默下调CCCP诱导的自噬28-29
• 5 CCCP诱导的自噬依赖于SG的组分G3BP129-31
• 6 讨论31-33
• 二、RHA参与细胞颗粒形成的研究33-42
• 1 免疫荧光验证RHA与PKR的相互作用33-34
• 2 RHA的N端和PKR的N端在两者募集入细胞颗粒中起着重要作用34-36
• 3 RHA，PKR和TIA-1 聚集于dsRNA诱导的细胞颗粒中36-38
• 4 RHA，PKR形成的细胞颗粒作用是不同的38-40
• 5 讨论40-42
• 创新性42
• 研究展望42-43
• 参考文献43-47
• 缩略语表47-49
• 攻读硕士学位期间发表和待发表的论文49-50
• 致谢50

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1 金由辛;;面向21世纪的RNA研究[A];面向21世纪的科技进步与社会经济发展（下册）[C];1999年

2 ;第四届RNA全国研讨会大会报告日程安排[A];第四届全国RNA进展研讨会论文集[C];2005年

3 ;Function of Transfer RNA Modifications in Plant Development[A];植物分子生物学与现代农业——全国植物生物学研讨会论文摘要集[C];2010年

4 王峰;张秋平;陈金湘;;棉花总RNA的快速提取方法[A];中国棉花学会2011年年会论文汇编[C];2011年

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6 夏海滨;;小RNA在免疫学领域中的应用研究进展[A];中国免疫学会第五届全国代表大会暨学术会议论文摘要[C];2006年

7 ;The stability of hepatitis C virus RNA in various handling and storage conditions[A];中国输血协会第四届输血大会论文集[C];2006年

8 郭德银;;RNA干扰在病毒研究和控制中的应用[A];2006中国微生物学会第九次全国会员代表大会暨学术年会论文摘要集[C];2006年

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  本文关键词：MDA5及RNA解旋酶A参与细胞应激反应的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：266817