多房棘球绦虫HSP20蛋白的生物信息学分析、重组表达及泡球蚴的体外培养

发布时间：2017-03-25 05:01

  本文关键词：多房棘球绦虫HSP20蛋白的生物信息学分析、重组表达及泡球蚴的体外培养，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：利用生物信息学方法对多房棘球绦虫热休克蛋白20(EmHSP20)的结构和功能进行预测分析,并在大肠杆菌原核表达系统中表达EmHSP20重组蛋白。方法：利用多种生物信息学软件对EmHSP20的结构和功能进行预测分析。将多房棘球绦虫HSP20编码序列整合到pET-28b(+)载体质粒上,然后转化入DH5a菌株,双酶切和测序鉴定重组质粒,然后将其转化入Rosetta(DE3)表达菌株,经诱导表达后用镍柱纯化,Western Blot鉴定重组蛋白并进行纯度分析和浓度测定。结果：EmHSP20基因全长1261bp,编码序列长945bp,编码314个氨基酸,理论相对分子质量为35843.7Da,等电点为5.92。EmHSP20无信号肽,无跨膜区,属胞内蛋白。EmHSP20含有典型的两个α-晶体结构域；富含4种类型的蛋白质功能位点,主要是磷酸化位点,说明磷酸化是其重要的翻译后修饰；含有8个蛋白质结合位点,可与多种蛋白质相结合。成功构建了EmHSP20重组质粒及原核表达体系,经Western Blot鉴定所得蛋白确为HSP20, SDS-PAGE分析显示蛋白纯度较高,测定浓度为1.1mg/mL。结论：通过生物信息学方法获得了EmHSP20的基本信息,成功构建了EmHSP20重组子,并利用大肠杆菌原核表达系统高效表达了EmHSP20,为进一步研究其免疫保护力及生物学功能奠定了基础。目的:用不同血清和培养基体外培养泡球蚴,以寻找更适合泡球蚴生长的体外培养条件。方法:分别采用DMEM、RPMI1640培养基和脂牛血清、小鼠血清、马血清不同条件体外培养泡球蚴,记录其生长情况并观察囊泡形态和超微结构,寻找更适合泡球蚴生长的体外培养条件。结果：经不同条件体外培养泡球蚴,发现DMEM-小鼠血清的培养条件下泡球蜘生长速度最快,囊泡数达34个,DMEM-胎牛血清培养条件下囊泡数为26个,RPMI1640-小鼠血清13个,RPMI1640-胎牛血清9个,而DMEM-马血清和RPMI1640-马血清的条件下无囊泡生长。小鼠血清培养的裹泡体积整体较胎牛血清培养的窦泡体积偏小。透射电镜观察四种囊泡超微结构无差异。结论:体外培养结果显示,小鼠血清比常规使用的胎牛血清、马血清更适合泡球蚴生长,DMEM比RPMI1640更造合泡球蚴生长。
【关键词】：多房棘球绦虫 热休克蛋白20 生物信息学 泡球蚴 体外培养
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R383.3
【目录】：

• 第一部分 多房棘球绦虫HSP20蛋白的生物信息学分析与重组表达6-50
• 中文摘要6-7
• Abstract7-9
• 引言9-12
• 第一章 多房棘球绦虫HSP20蛋白的生物信息学分析12-28
• 1.1 材料12
• 1.2 方法12
• 1.2.1 寻找EmHSP20的开放阅读框12
• 1.2.2 EmHSP20氨基酸序列的生物信息学分析12
• 1.3 结果12-28
• 1.3.1 EmHSP20的开放阅读框及编码氨基酸12-13
• 1.3.2 EmHSP20氨基酸序列的blastp分析13-14
• 1.3.3 EmHSP20蛋白的理化性质及疏水性分析14-16
• 1.3.4 EmHSP20的跨膜区预测16
• 1.3.5 EmHSP20的信号肽及亚细胞定位预测16-17
• 1.3.6 EmHSP20 B细胞线性表位的预测17-18
• 1.3.7 EmHSP20的二级结构分析18-23
• 1.3.8 EmHSP20的保守结构域分析23
• 1.3.9 EmHSP20的三维结构预测23-24
• 1.3.10 EmHSP20同源性分析及分子进化树的构建24-28
• 第二章 多房棘球绦虫HSP20蛋白的重组表达28-44
• 2.1 材料28-32
• 2.1.1 质粒和菌株28
• 2.1.2 主要试剂28
• 2.1.3 主要实验仪器和设备28-29
• 2.1.4 主要溶液的配制29-32
• 2.2 方法32-37
• 2.2.1 重组质粒的构建32-34
• 2.2.2 重组蛋白的原核表达34-36
• 2.2.3 重组蛋白的纯化36
• 2.2.4 纯化后蛋白的分析36-37
• 2.3 结果37-44
• 2.3.1 EmHSP20-pET-28b(+)重组质粒的双酶切鉴定37-38
• 2.3.2 重组质粒插入片段的测序鉴定38-40
• 2.3.3 EmHSP20重组蛋白在Rosetta(DE3)中的表达及定位40-41
• 2.3.4 梯度洗脱液的SDS-PAGE分析41-42
• 2.3.5 重组蛋白的Western Blot分析42
• 2.3.6 重组蛋白的SDS-PAGE纯度分析42-43
• 2.3.7 重组蛋白的浓度测定43-44
• 讨论44-49
• 结论49-50
• 第二部分 泡球蚴的体外培养50-65
• 中文摘要50-51
• Abstract51-52
• 引言52-54
• 材料与方法54-59
• 1.1 材料54-56
• 1.1.1 泡球蚴54
• 1.1.2 人肝癌细胞株HepG254
• 1.1.3 主要试剂54
• 1.1.4 主要实验仪器和设备54-55
• 1.1.5 主要溶液的配制55-56
• 1.2 方法56-59
• 1.2.1 肝癌细胞HepG2的培养56-57
• 1.2.2 泡球蚴的体外培养57-59
• 结果59-63
• 2.1 泡球蚴生长曲线59-60
• 2.2 光学显微镜下的囊泡形态60-62
• 2.3 囊泡超微结构的观察62-63
• 讨论63-64
• 结论64-65
• 参考文献65-69
• 在学期间的研究成果69-70
• 致谢70-71
• 英文缩略语表71-72

【共引文献】

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1 曾红春;大鼠肝泡状棘球蚴多模态影像学的动态观察与分析[D];新疆医科大学;2013年

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本文编号：266666