拓扑异构酶Ⅱa在小鼠SVZ成体神经发生过程中的作用和机制研究

发布时间：2020-05-25 14:56

【摘要】：研究背景:成体神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)是一类局限在成年神经系统特定部位的、可以发挥持续增殖以及多潜能分化功能的细胞。它们对于脑组织完整细胞结构的维持和正常功能的发挥具有重要作用。在成年小鼠大脑中,脑室下区(subventricular zone,SVZ)是NSCs及其子代细胞聚集的主要部位,这些增殖旺盛的细胞在小鼠整个生命过程中保持自我更新的能力,其中一部分经过迁移到达嗅球,分化为嗅球中间神经元。成体神经干细胞的这一生理过程受到多种因子的调控,比如细胞外信号BMP和Notch参与维持NSCs的静息状态,Wnt信号能促进NSCs及其子代细胞增殖并激活神经发生过程。然而,有关细胞内在因素对NSCs的调控作用,目前尚不清楚。拓扑异构酶Ⅱa(TopoisomeraseⅡa,Top2a)是哺乳动物细胞核内广泛存在的一类酶,它可以催化DNA双链的断裂与重连,从而改变DNA链的拓扑学结构,对于细胞复制、RNA转录以及DNA损伤修复等过程起到重要作用。Top2a对于细胞分裂增殖过程极其重要,在胚胎发育中敲除Top2a会导致胚胎发育停滞在4细胞或8细胞状态。然而,在神经发育过程中,尤其是在成体神经发生中,Top2a的作用还未见报道。实验方法:我们利用生物信息学的方法筛选出多个可能对成体神经发生起作用的候选基因,并通过RT-PCR、Western Blotting等方法对这些候选基因在NSCs中的表达进行了验证,并从中选定Top2a作为研究的目标分子。通过免疫荧光染色方法,我们对Top2a在成年小鼠中枢神经系统中的表达模式进行了分析。然后,利用Top2a的特异的抑制剂、RNA干扰质粒以及条件性诱导的敲除小鼠对其在成体NSCs中的作用进行了探究。最后,利用CHIP-seq和RNA-seq技术对Top2a的作用机制和下游靶点进行了探索。主要结果:通过分析已有的芯片和测序数据,我们筛选出了多个NSCs的潜在特征性基因,包括Aurka、Aurkb、Birc5、Bub1b、Ccna2、Cdc20、Cdc25c、Cdc45、Cdc6、Cdk1、Cdt1、Cenpa、Cenpf、Dbf4、Dlgap5、Kif23、Kif2c、Mcm3、Mcm5、Mcm6、Mcm7、Plk1、Top2a和Ube2c等。经蛋白水平上验证,这些基因当中Kif2c和Top2a特异地表达在NSCs上。因此,我们选取Top2a作为目标分子,研究其在成体神经发生中的作用。通过分析Top2a在中枢神经系统内的表达模式,我们发现该分子特异地表达在成年小鼠的SVZ和RMS中,其它脑区几乎不表达;并且这种表达的空间特异性在发育早期就已经决定。另外,通过分析SVZ处Top2a的细胞定位,我们发现它主要表达在NPCs以及活化的NSCs中。通过体外培养SVZ来源的成体神经干细胞,我们发现Top2a被抑制后,干细胞的生长状态明显下降,且其增殖能力显著降低。同时,我们还构建了条件性诱导的基因敲除小鼠,发现体内敲除Top2a可以明显抑制成体SVZ处神经发生过程,并使该处增殖细胞的数目明显减少,从而导致嗅球内新生神经元的数量显著降低。通过CHIP-seq和RNA-seq检测分析,我们进一步揭示了Top2a对NSCs转录组的影响,发现了310个可能的Top2a直接作用的下游靶基因,为揭示成体神经发生中Top2a发挥功能的分子机制奠定了基础。结论:根据目前的研究结果,我们可以得到如下结论:1、Top2a是神经干细胞表达的一个特征性分子。2、与Top2b(Top2a的同源异构体)比较,Top2a主要表达在成体SVZ和RMS部位,具有独有的时间-空间表达模式。3、体外干扰或者抑制Top2a后,神经干细胞球的正常生长受到抑制,说明Top2a是维持体外NSCs正常增殖和生长的关键分子。4、在小鼠体内条件性敲除Top2a后,SVZ处的神经发生受到抑制,并且影响了嗅球内新生中间神经元的产生。5、由Top2a在全基因组上的结合位点以及敲除Top2a后各个基因的差异表达,我们推测核孔蛋白Nu153和转录因子Sox2可能是介导Top2a功能的下游靶基因。
【图文】：

导其到下一个 DNA 切断位点yb Top2a 启动子 反式激活 Top2a [61]BP90 Top2a 启动子的 ICB2 元件 使内源 Top2a 表达上调 [62]1 结合于 Top2a 启动子的近端和远端 GC 元件对 Top2a 起转录激活作用 [63]3 结合于 Top2a 启动子的远端 GC 元件对 Top2a 起转录抑制作用 [63]-M Top2a 启动子 最强的 Top2a 反式激活因子，受内源性调控程度低[64]s1p 不详 为 Top2 发挥分离染色体功能所必需，维持正常的细胞生长状态[65]M 不详 Sgs1p 同源类似物，，人体缺乏可导致 Bloom 综合征[66]atenin 结合于Top2a 的 951 1301氨基酸加快 Top2a 的作用循环 [67]1 作用于 Top2a 的 Ser1337和Ser1524使Top2a作用部位的丝氨酸磷酸化，调控细胞周期进程[68]
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R338

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本文编号：2680317