miR-34a通过调控N-myc表达抑制MDSCs凋亡的研究

发布时间：2017-03-26 11:17

  本文关键词：miR-34a通过调控N-myc表达抑制MDSCs凋亡的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：microRNAs (miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,其大小长约20～25个核苷酸。近年来研究表明miRNAs在生物学的各个过程中发挥了极其重要的作用：如细胞和个体发育、器官形成、造血生成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢、细菌与病毒的感染和机体防御、炎症的发生发展等。同样,microRNAs在免疫系统中亦有很好的研究。已有的研究表明microRNAs在T细胞、B细胞、DC、NK细胞分化发育中均发挥重要作用,从而参与了机体先天免疫和获得性免疫应答。Rafael Casellas实验室的研究结果表明niR-34a在各种免疫细胞中呈现出不同的表达水平,由此我们推测miR-34a可能在淋巴细胞的分化发育中发挥重要作用。为进一步探讨miR-34a在淋巴细胞分化发育中的作用,在本课题中,我们主要通过建立miR-34a嵌合小鼠模型和miR-34a转基因小鼠模型并应用这两种动物模型来探讨miR-34a在淋巴细胞分化发育中的作用。首先,我们构建了miR-34a过表达质粒pMDH 1-PGK-GFP-miR-34a,并通过qPCR、流式分析等验证了miR-34a过表达质粒pMDH 1-PGK-GFP-miR-34a的成功表达,在此基础上,我们一方面制备了miR-34a的逆转录病毒,感染小鼠的骨髓干细胞,建立了miR-34a的嵌合小鼠模型,通过PCR及FACS验证了小鼠模型的成功构建；另一方面,我们将pMDH 1-PGK-GFP-miR-34a用Hind Ⅲ酶切线性化,经显微注射到受精卵细胞中制备了miR-34a转基因小鼠模型。经FACS分析发现：无论在嵌合小鼠中,还是在转基因小鼠模型中,过表达了miR-34a后,无论是在骨髓还是在脾脏中,B细胞的数目均有显著减少,此结果与Baltimore实验室研究结果一致,进一步说明了嵌合小鼠模型和转基因小鼠模型的构建成功。进一步研究发现,过表达miR-34a后,无论是在嵌合模型还是在转基因模型中,髓系来源的抑制性细胞(Myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)都显著高于其在正常小鼠体内的比例,且在转基因小鼠模型中发现MDSCs的绝对数升高。通过BrdU染色研究发现BM和脾脏中BrdU阳性细胞比例未见显著差异,这一结果提示miR-34a并不影响MDSCs细胞的自我更新或增殖。进一步分析MDPs等早期分化祖细胞发现：和WT小鼠比较,MDPs, GMPs等祖细胞比例未发现有显著差异,但用Annexin Ⅴ染色,经FACS检测发现,转基因小鼠的MDSCs的凋亡明显减少,这提示着miR-34a很可能是通过减少MDSCs的凋亡而使其百分比和绝对数增高。为进一步分析miR-34a抑制MDSCs凋亡的作用机制,寻找1niR-34a在MDSCs中的靶基因,我们应用miRWalk软件预测、荧光素酶报告系统检测以及实时定量PCR及Western-blot等研究发现, miR-34a可能通过作用于N-myc等来调控MDSCs的发育。为进一步探讨miR-34a是否影响MDSCs的功能,我们应用流式细胞仪分选MDSCs,并应用实时定量PCR检测发现：和WT MDSCs相比,脾脏中niR-34a过表达的MDSCs产生高水平的TNF、iNOS、IL-17,而Arg、TGF-β的表达较低。但在BM MDSCs中miR-34a过表达后TNF、iNOS、IL-6、IL-10、IL-12等表达较高。为验证这种细胞因子表达谱的变化是否影响MDSCs的功能,我们分别在miR-34a和WT小鼠中建立LLC小鼠模型,发现两组肿瘤生长并无显著差异。考虑到miR-34a同样在其他细胞中过表达,为排除其他细胞的影响,我们从miR-34a转基因模型中纯化BM MDSCs并在肿瘤注射前通过眼静脉方式注射到小鼠体内,和WT MDSCs输注组相比,miR-34a MDSCs并未显著影响LLC肿瘤在体内的生长。这些结果提示尽管miR-34a改变了MDSCs细胞因子的表达谱,但并未影响MDSCs对肿瘤生长的影响。总结我们现有研究,我们成功建立了miR-34a过表达嵌合小鼠和转基因小鼠动物模型,通过研究发现,miR-34a通过抑制N-myc等分子的表达从而抑制了MDSCs的凋亡,尽管miR-34a过表达后影响了MDSCs的细胞因子的表达谱,但并不影响MDSCs对肿瘤的生长。这一系列的研究一方面揭示了miR-34a对MDSCs分化发育及凋亡等的影响,同时,也为microRNAs在淋巴细胞的生物学行为影响提供新的依据。
【关键词】：miRNAs miR-34a 嵌合小鼠 转基因小鼠 MDSC 发育
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 前言11-14
• 第一部分 miR-34a小鼠表型的分析14-32
• 材料和方法14-17
• 一、实验材料14-15
• 二、实验方法15-17
• 实验结果17-30
• 一、miR-34a过表达骨髓嵌合小鼠模型的表型分析17-19
• 二、miR-34a过表达转基因小鼠模型的表型分析19-24
• 三、miR-34a对淋巴细胞的增殖及凋亡的影响24-28
• 四、miR-34a对CMP、GMP发育的影响28-30
• 讨论30-32
• 第二部分 miR-34a的靶基因分析及验证32-49
• 材料和方法32-40
• 一、实验材料32-34
• 二、实验方法34-40
• 实验结果40-47
• 一、miR-34a靶基因的生物学预测40-41
• 二、miR-34a报告质粒的构建41-45
• 三、N-myc是否是miR-34a在MDSCs发育过程中靶基因的验证45-47
• 讨论47-49
• 第三部分 miR-34a对MDSCs功能的研究49-58
• 材料和方法50-53
• 一、实验材料50
• 二、实验方法50-53
• 实验结果53-56
• 讨论56-58
• 结论58-60
• 参考文献60-63
• 综述63-86
• 参考文献76-86
• 硕士期间完成的论文86-87
• 附录87-90
• 致谢90

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本文编号：268739