基于光亲和多肽探针库鉴定酪氨酸磷酸化结合蛋白的研究

发布时间：2020-05-31 20:33

【摘要】：细胞信号转导往往通过蛋白质-蛋白质的动态相互作用实现。一旦一个信号被终止,相互作用的信号蛋白就会及时分离,使细胞回到一个基本状态,准备对下一个刺激做出反应。这些动态蛋白质相互作用的关键环节是由模块化结构域去亲和识别具有特殊序列特征的结构来完成的。酪氨酸磷酸化(Phosphorylation tyrosine,pY)作为一种特殊信号对接位点,介导着信号转导的重要通路,与人类疾病的发生发展密切联系。目前的研究表明,人类细胞中预计存在数以万计的酪氨酸磷酸化位点,而它们与特异性识别结构域(如SH2结构域)的作用网络并不十分清楚,严重制约了这一领域发展。然而,由于酪氨酸磷酸化和识别蛋白的丰度往往都很低,其介导的蛋白互作结合力较弱,且常常瞬时发生,因此它们的互作分析非常具有挑战。本论文,我们构建并表达了GST-SRC_(SH2)蛋白,用以模拟酪氨酸磷酸化结合蛋白反应的关键结构域,并以SHC1-pY~(317)为例,设计并制备了一种酪氨酸磷酸化光亲和探针,用于强效而特异性地富集其靶标蛋白。我们先优化了这类探针反应所需要的最佳体系,我们的结果表明,所开发的探针即使在复杂的环境中也能高选择性地捕获特异性结合的靶蛋白。根据设计的第一条光交联亲和探针,我们希望其在专一性和特异性满足的基础上,进一步拓展靶标蛋白的富集范围。因此,我们在此基础上引入组合多肽配体库(CPLL)技术,构建了酪氨酸磷酸化的组合光亲和探针库,然后与基于质谱的蛋白质组学技术相结合,鉴定到了24个具有SH2结构域的特异性酪氨酸磷酸化结合蛋白,这与以往报道的方法相比,具有更好的富集效果。此外,我们还发现了一些尚未报道但对pY具有潜在结合能力的识别蛋白,借助生化手段和定量蛋白质组学技术,以及结构分析,我们验证了PKN2对pY的特异性识别能力。我们的实验结果表明,该方法不仅可以表征酪氨酸磷酸化与SH2结构域的动态互作,还应可用于探索、挖掘未知的蛋白质翻译后修饰的特异性识别蛋白。
【图文】：

多肽探针 1（p-3）：FD-Bpa-PS-(pY)-VNVQNLK(Biotin)对反应浓度优化,以最大强度为 100 计算光照时间的优化图 1.6，我们将胶图中的条带进行提取，通过条带的强度确定探针的富将最高值统一归一化到 100%。由此我们制作了柱状图，来更清晰直观针的富集效率。通过胶图和柱状图我们可以发现，目标产物的量随着射时间的延长而明显增加，当照射时间超过 30 分钟时，目标产物的产著提高。因为在 365 nm 紫外的照射下，虽然探针与 GST-SRCSH2蛋白交联反应，但是同时会因温度的迅速升高产生蛋白的降解，影响富集得注意的是，与没有紫外交联的阴性对照相比，探针显示目标富集率，这意味着蛋白捕捉拥有紫外依赖性。在光照接近 30 min 时，探针SRCSH2蛋白交联效率最好。因此我们选择 30 min 作为后续实验的光照条

探针 1（p-3）：FD-Bpa-PS-(pY)-VNVQNLK(Biotin)光间优化，以最大强度为 100 计算系盐离子的浓度优化结合缓冲液的盐浓度对特定的蛋白质-蛋白质相互作用究了不同的结合缓冲液对目标物富集率的影响[59]。如图增加到 1×结合缓冲液，捕获的目标显著增加，，盐浓度过果明显下调。因此，在随后的实验中，我们选择 1×结合质。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R341

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本文编号：2690418