维生素D和VSL#3对炎症相关结直肠癌小鼠模型的干预研究

发布时间：2020-06-01 03:14

【摘要】：研究背景:炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一种慢性非特异性肠道炎症,是发生结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)的高危因素。维生素D(VitaminD,VitD)是一种脂溶性类固醇激素,已被证实与肿瘤、炎症、免疫性疾病等相关。VSL#3是一种复合益生菌,大量的研究已证实其具有抗炎抗癌的作用。VitD、肠道菌群和益生菌之间存在密切的联系,且VitD和益生菌对炎症相关性结直肠癌(Colitis-associated colorectal cancer,CAC)均存在预防作用。研究目的:(1)探究VitD与VSL#3单独或联合作用对CAC模型小鼠成瘤的影响;(2)探究VitD与VSL#3对炎症因子的影响;(3)探究VitD与VSL#3作用对肠粘膜上皮E-cadherin表达的影响;(4)探究VitD与VSL#3对miRNA的作用效果。研究方法:将雄性C57BL/6小鼠随机分为7组,空白对照组n=9,不建立CAC模型,其余各组n=10,均建立CAC模型。(1)建模:建模组于第7天12.5%氧化偶氮甲烷(Azoxymethane,AOM)腹腔注射,第14天开始连续给予2.5%葡聚糖硫酸钠(Dextransulfatesodium,DSS)饮用5天,至第19天结束。空白对照组以0.9%NaCl溶液代替AOM,普通饮用水代替DSS;(2)干预:空白对照组(0.9%NaCl溶液灌胃)、模型对照组(0.9%NaCl溶液灌胃)、低剂量VitD组(VitD5IU/g/次灌胃)、高剂量 VitD 组(VitD 10IU/g/次灌胃)、低剂量 VitD+VSL#3 组(VitD 5IU/g/次+VSL#35×107CFU/g/次灌胃)、高剂量 VitD+VSL#3 组(VitD 10IU/g/次+VSL#35×107CFU/g/次灌胃)、VSL#3 组(VSL#3 5×107CFU/g/次灌胃),每周 3 次,共33次;(3)评估:至第77天处死小鼠,计算小鼠结直肠成瘤数(Tumornumber,TN)和瘤负荷(Tumor load,TL),对结直肠进行病理组织学评估;利用qRT-PCR评估结直肠组织IL-8及TNF-αmRNA的表达水平,以及miR-21、miR-194、miR-145的表达水平;分别利用qRT-PCR及免疫组织化学染色法评估结直肠组织E-cadherin的mRNA及蛋白表达水平。研究结果:(1)所有建模小鼠结直肠均可见成瘤,成瘤率100%。与模型对照组相比较,予以VitD和VSL#3干预的小鼠结直肠瘤负荷均有下降,其中VSL#3组瘤负荷较模型对照组显著下降(0.69±0.18vs1.49±0.27cm,P=0.03),其余各组较模型对照组瘤负荷下降,但未达到统计学差异(P0.05);(2)与空白对照组相比,模型对照组小鼠肠道组织TNF-αmRNA表达水平显著增加(0.68±0.09 vs 12.93±3.04,P=0.02)。经VSL#3干预,与模型对照组相比,VSL#3组小鼠结直肠组织TNF-αmRNA 表达水平显著下降(12.93±3.04 vs 2.34±0.36,P=0.02);(3)qRT-PCR 及IHC结果显示,建模后E-cadherin表达水平较空白对照组无明显变化(P0.05)。进一步经VSL#3干预后,结直肠E-cadherin表达水平较模型对照组亦无明显变化(P0.05);(4)与空白对照组相比,AOM/DSS建模可使结直肠组织miR-21表达均值增加(0.82±0.12vs3.76±2.44,P=0.30)和 miR-145 的表达均值下降(1.92±0.97 vs0.50±0.19,P=0.21),但均未达统计学差异,而VSL#3干预对miR-21和miR-145表达无明显影响。对于miR-194,AOM/DSS建模或给予VSL#3干预均未能明显改变其表达(P0.05)。结论:(1)利用AOM/DSS可成功建立小鼠CAC模型,VSL#3可显著降低其瘤负荷,而联合VitD和VSL#3对AOM/DSS模型小鼠的减瘤效果较单独VitD或VSL#3并未表现出更好的减瘤效果;(2)AOM/DSS建模可上调小鼠结直肠组织TNF-αα的表达,而VSL#3干预可显著降低TNF-α的表达,VSL#3可能是通过抑制炎症以降低CAC风险;(3)AOM/DSS建模及VSL#3干预对小鼠结直肠组织的E-cadherin,miR-21,miR-145,miR-194的表达并无显著影响。
【图文】：

示意图,灌胃,益生菌,腹腔注射

图１：邋ＡＯＭ／ＤＳＳ诱导的小鼠ＣＡＣ模型及维生素Ｄ、益生菌干预示意图逡逑注：ＮＳ０．９％ＮａＣｌ溶液；ｉ．ｐ．腹腔注射逡逑表７：实验分组和处理逡逑分组逦干预逦数目（ｎ）逡逑空白对照组逦０．９％ＮａＣｌ溶液腹腔注射＋普通饮用水９逡逑＋０．９％ＮａＣｌ溶液灌胃逡逑模型对照组逦ＡＯＭ＋ＤＳＳ＋０．９％ＮａＣｌ溶液灌胃逦１０逡逑低剂量邋ＶｉｔＤ邋组邋ＡＯＭ＋ＤＳＳ＋ＶｉｔＤ３邋灌胃（５ＩＵ／ｇ／次，３邋次／周）邋１０逡逑高剂量邋ＶｉｔＤ邋组邋ＡＯＭ＋ＤＳＳ＋ＶｉｔＤ３灌胃（１０ＩＵ／ｇ／次，３邋次／周）１０逡逑低剂量邋ＶｉｔＤ＋ＶＳＬ＃３邋ＡＯＭ＋ＤＳＳ＋ＶｉｔＤ３邋（邋５ＩＵ／ｇ／次）与邋ＶＳＬ＃３邋１０逡逑组逦（５ｘｌ0７ＣＦＵ／ｇ／次）联合灌胃（３次／周）逡逑高剂量邋ＶｉｔＤ＋ＶＳＬ＃３邋ＡＯＭ＋ＤＳＳ＋ＶｉｔＤｊ邋（邋１０ＩＵ／ｇ／次）与邋ＶＳＬ＃３邋１０逡逑组逦（５ｘｌ0７ＣＦＵ／ｇ／次）联合灌胃（３次／周）逡逑

小鼠,情况,远端,肿瘤

实验结果逡逑１．邋ＡＯＭ／ＤＳＳ诱导的小鼠ＣＡＣ模型的建立逡逑第７７天处死小鼠后，大体观察结果（图３）显示空白对照组结直肠未见肿瘤形逡逑成，而其余各组小鼠结直肠均可见肿瘤形成，ＡＯＭ／ＤＳＳ建模成瘤率１００％。所形成逡逑肿瘤主要位于结直肠远端及中远端，其中远端直肠肛门处成瘤率８６％邋（４３／５０），中逡逑远端结肠成瘤率７２％邋（３６／５０）。４０％邋（２０／５０）的小鼠可见直肠靠近肛门处数个肿瘤逡逑环腔生长（４０％，２０／５０）。进一步病理组织切片结果（图４）显示所形成的结直肠肿逡逑瘤均为原位癌，致上皮层受累但未突破粘膜肌层。受累部分结直肠腺体结构紊乱，，逡逑各肿瘤细胞形态及大小差异显著，肿瘤细胞核大、深染、质核比下降，可见明显的逡逑异型性。逡逑空白对照逡逑0邋１ｃｍ邋２逦３逦５逦６逦７逦８逦９逡逑■。s{ｂ逡逑Ａ0Ｍ？逡逑０邋１ｃｍ邋２逦３逦４逦５逦６逦７逡逑图３：小鼠结直肠大体情况。逡逑图４：小鼠结直肠组织ＨＥ染色结果（４０0ｘ）逡逑注：Ａ：正常小鼠结直肠组织ＨＥ染色（４０0
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R574.62;R735.3;R-332

【参考文献】