弓形虫氨基肽酶N3的定位和酶动力学研究
发布时间：2020-06-01 06:13
【摘要】：弓形虫是一种专性细胞内寄生原生动物,属于顶端复合体,可感染几乎所有.的有核细胞,引起人畜共患的弓形虫病。目前,弓形虫病尚无有效治疗药物,迫切需要找到有效的药物靶点,以开发治疗弓形虫的新型药物。氨基肽酶作为一种蛋白酶在蛋白质成熟、多肽降解和蛋白质稳定等方面起关键性作用,并作为药物靶点已在人类和动物疾病的防治上得到了广泛的研究,尤其是疟原虫病的防治已经将这些氨基肽酶联合作为有效的药物靶点,而关于弓形虫氨基肽酶的研究,非常少见。因此,本研究为氨基肽酶作为弓形虫药物靶点的研究提供理论依据,以弓形虫为研究对象,系统分析弓形虫氨基肽酶N3(TgAPN3)的亚细胞定位和生化特性。研究结果如下:通过同源性比对显示,TgAPN3的氨基酸序列与哈氏哈蒙德虫酶具有高度同一性(97%),与人源氨基肽酶N的同源性较低(24%);细胞定位分析显示TgAPN3定位于虫体的胞浆内,与致密颗粒的标志性蛋白共定位;为了分析TgAPN3的酶活性,使用大肠杆菌对重组的弓形虫氨基肽酶N3(rTgAPN3)进行了体外表达,纯化后的蛋白对H-Ala-MCA荧光底物显示出了明显的酶活性;pH的变化对TgAPN3的酶活性有明显的影响，该酶在酸性范围内显示出良好的活性,在pH为7.0时显示出了最大酶活性;不同金属离子影响TgAPN3的酶活性,与其他金属离子相比,Co2+离子对酶活性的增强效果最为明显;底物偏好性鉴定结果显示,该酶优先选择含有N-末端为Ala残基的底物,其次是Tyr和Cys;酶抑制剂的鉴定结果显示,bestatin和phebestatin显著抑制了 rTgAPN3的酶活性。因此,TgAPN3在酸性环境及金属离子Co2+作用下,以H--Ala-MCA作为底物时具有高活性。弓形虫分裂期间在致密颗粒和PV中检测到TgAPN3,表明致密颗粒蛋白成熟和分泌的潜在作用。这结果对TgAPN3的定位分析为其功能研究奠定了基础,而TgAPN3体外生化特性的鉴定为该酶作为弓形虫药物靶点的研究提供了重要的理论依据。
【图文】：
图１邋ＴｇＡＰＮ３的序列比对、进化树和分子建模逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋Ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ａｌｉｇｎｍｅｎｔ，邋ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ邋ｔｒｅｅ邋ａｎｄ邋ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｍｏｄｅｌｉｎｇ邋ｏｆ邋ＴｇＡＰＮ３逡逑２弓形虫ＡＰＮ３的表达逡逑如预期的那样，，表达含有Ｎ端Ｈｉｓ标签的ｒＴｇＡＰＮ２蛋白。通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ评估逡逑ｒＴｇＡＰＮ３的分子量为１０８ｋＤａ。逡逑ＢＳＡ邋（ｎｇ／ｕｆ）逡逑ｒＴｇＡＰＮ３邋Ｍ邋１２５逦２５０邋５００邋１０００逡逑ＫＤａ邋．．．．．．．．．．逦．一逦逦逡逑１８０邋—逡逑１３０—逦—逡逑９５一＾＾邋一逡逑７２一S茫樱蓿纾蓿椋礤义希担怠濉ㄥ我槐劐义希矗冲濉义蟨海浚В惧危В骸㈠危海觯垮义希常村濉伪蝗纾义希玻跺濉诲我唬у义希蓿螅恚恚浚藉澹浚恚浚哄义
本文编号：2691068
【图文】：
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