白纹伊蚊唾液特异性rAlb-34k2蛋白致炎效应的初探

发布时间：2020-06-09 23:48

【摘要】：目的:从体内实验及体外实验中探讨rAlb-34k2蛋白对鼠耳肥大细胞活化及对Raw264.7细胞表达细胞因子、趋化因子的调控作用。方法:1)以Balb/c小鼠为实验对象,以0.6%醋酸、灭活rAlb-34k2蛋白和rAalb-CTL2蛋白(原核重组表达的另一种白纹伊蚊唾液分泌性蛋白)为实验对照,通过皮下注射rAlb-34k2蛋白(294.1pM),利用甲苯胺蓝染色法检测小鼠鼠耳肥大细胞脱颗粒率的变化;用ELISA法检测小鼠鼠耳组织液中组胺释放的变化。2)以小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞为实验对象,以rAalb-CTL2蛋白为实验对照,用不同浓度的rAlb-34k2蛋白(29.41pM/mL、294.1pM/mL)刺激Raw264.7细胞,利用qRT-PCR方法检测刺激后6h和24h时Raw264.7细胞促炎细胞因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)、抑炎细胞因子(IL-10)、中性粒细胞趋化因子(CXCL2)及单核细胞趋化因子(CCL2)mRNA水平的表达变化;利用ELISA方法检测Raw264.7细胞培养上清中促炎细胞因子(IL-6、IL-1β)蛋白水平的表达变化。结果:1)肥大细胞脱颗粒率检测结果:在rAlb-34k2蛋白(294.1pM)刺激小鼠鼠耳20分钟时,各组肥大细胞脱颗粒率分别为:22.33%(阴性对照组)、49.00%(rAlb-34k2组)、49.75%(阳性对照组)、40.40%(rAalb-CTL2组)、41.25%(灭活rAlb-34k2组),rAlb-34k2组与阴性对照组间具有统计学差异(P0.001);组胺释放检测结果:rAlb-34k2蛋白(294.1pM)刺激鼠耳20分钟时,各组组胺释放未检测到明显变化。2)细胞因子及趋化因子检测结果:与正常细胞对照组相比,在蛋白干预Raw264.7细胞6h时,低浓度(29.41pM/mL)和高浓度(294.1pM/mL)的rAlb-34k2蛋白组均能上调细胞因子IL-6(上调倍数分别为41倍,P0.001和138倍,P0.001)、IL-1β(上调倍数分别为14倍,P0.001和31倍,P0.001)、TNF-α(上调倍数分别为2倍,P0.001和3倍,P0.001)、IL-10(上调倍数分别为2.3倍,P0.001和2.7倍,P0.001)的mRNA表达,亦能上调趋化因子CXCL2(上调倍数分别为4.7倍,P0.001和10倍,P0.001)、CCL2(上调倍数分别为6倍,P0.001和9倍,P0.001)的mRNA表达;24h时,低浓度的rAlb-34k2蛋白组均能上调细胞因子IL-6(上调倍数为187倍,P0.001)、IL-1β(上调倍数为26倍,P0.001)、TNF-α(上调倍数为2.2倍,P0.001)、IL-10(上调倍数为5.4倍,P0.001)的mRNA表达,亦能上调趋化因子CXCL2(上调倍数为11倍,P0.001)、CCL2(上调倍数为15倍,P0.001)的mRNA表达;此外,在时间动态上观察(6h~24h),低浓度组的各因子(IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10、CXCL2、CCL2)均表现出持续上升状态,而rAalb-CTL2对照组各因子无明显变化;从蛋白水平来看,高浓度的rAlb-34k2蛋白(294.1pM/mL)具有促进Raw264.7细胞表达IL-6和IL-1β的作用。结论:1)rAlb-34k2蛋白在体内可活化小鼠鼠耳肥大细胞;2)rAlb-34k2蛋白在体外可促进小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞表达促炎细胞因子IL-6、IL-1β及趋化因子CXCL2、CCL2,且表现为蛋白剂量依赖型。这些结果提示rAlb-34k2蛋白具有促进炎症发生的作用,为探讨白纹伊蚊唾液34k2蛋白的生物学功能补充了实验依据。
【图文】：

鼠耳组胺检测结果上述结果可知，rAlb-34k2 蛋白具有促进小鼠鼠耳肥大细胞脱颗粒的作部分实验分别以 N.S 和 0.6%醋酸作为阴性和阳性对照，，选用双抗体夹 方法检测肥大细胞脱颗粒较为特异性的指标组胺，观察在 rAlb-34k2 作组胺的释放情况。组胺标准品的浓度（ng/mL）为横坐标，OD450值为纵坐标，建立三次方程（图 3），组胺的标准曲线回归方程为 y=0.00173+ 0.11256x 0.000512x3，r2=0.99975，说明标准曲线相关性较高，可用于后续实验。组胺果如图 4 所示，N.S 组、0.6%醋酸组和 rAlb-34k2 蛋白组之间未出现明

16图 4 rAlb-34k2 蛋白对小鼠鼠耳组胺释放的影响Fig. 4 Effects of rAlb-34k2 protein on histamine release in mouse ear的基因的熔解曲线、标准曲线用各基因特异性引物，均可扩增出与预期大小一致的目的基因（图引物可有效扩增。各基因的标准曲线如图 6 所示，标准曲线方程及系数如表 2 所示，0.998< r2<0.9997，扩增效率 90%< E <105%，说关性好，引物扩增效率较高。熔解曲线如图 7 所示，波峰单一、峰型特异性扩增。
【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392

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本文编号：2705443