B型流感嗜血杆菌寡糖缀合物疫苗的免疫活性研究相关单克隆抗体的制备

发布时间：2017-03-27 15:14

  本文关键词：B型流感嗜血杆菌寡糖缀合物疫苗的免疫活性研究相关单克隆抗体的制备，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae, Hi)是一类可以引起婴幼儿呼吸道感染进而会引起继发性疾病的病原菌。根据其有无荚膜,可分为有荚膜型和无荚膜型。无荚膜型细菌通常引起成人和儿童的局部感染；有荚膜型细菌可以引起较为严重的侵袭性感染。根据其细菌表面荚膜多糖的成分和抗原性的不同,有荚膜型细菌又可以分为a、b、c、d、e、f六种血清型,不能分型者称为不定型型。其中,B型流感嗜血杆菌(Hib)的致病力最强,它可以引起败血症,并由此引发脑膜炎、肺炎、会厌炎、蜂窝组织炎、心包炎和中耳炎等。Hib的感染对象主要是5岁以下的小儿,尤其是2岁以下的婴幼儿。目前,对于Hib感染的主要治疗是依靠抗生素。然而,近年来随着细菌耐药性的增加,特别是多重耐药性菌株的出现,采用疫苗预防Hib变得十分必要,因此该策略受到越来越多的重视。如今已有多种疫苗用于Hib的预防并且成效显著,但它们也存在一定的缺点,譬如价格昂贵且疫苗的质量和安全性难以控制等。与此同时,能够对Hib感染进行早期检测,以便给予及时的处理,对于实施有效的治疗、防止Hib的扩散及降低由感染引发的后遗症都是非常必要和有重要意义的,但是目前还缺乏特别有效的Hib检测方法。古巴科学家采用化学合成的方法制备获得了Hib细菌荚膜多糖的寡糖片段,并成功地将其应用研制新型的半合成Hib疫苗,证实具有良好的免疫效果,该疫苗已经在临床上得到广泛应用。这一研究表明了化学方法制备的具有单一结构、质量明确、安全性优良的寡糖抗原用于研发疫苗的可能性。此外,随着单克隆抗体技术的不断成熟及其在各个领域的广泛应用,如今以此技术为基础研发特异、高效的单克隆抗体检测试剂这一领域得到飞速发展,这为我们发展可以实现Hib感染早期检测的单克隆抗体试剂盒提供了可能。本课题的终极目标是研发针对Hib的新型糖疫苗,同时研发可用于Hib细菌诊断的单克隆抗体。为此,本课题组先后合成了以Hib的细菌荚膜多糖,即多聚核糖基核糖醇磷酸酯(PRP)的重复片段为基础的七(Hept).九(Nona)和十一(Undeca)聚糖,并将它们与作为载体蛋白的血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶合,形成糖蛋白结合疫苗Hept-KLH、Nona-KLH和Undeca-KLH。本论文对这些糖蛋白结合疫苗进行了全面的免疫学评价,并检测了其抗血清与Hib10211菌株的结合力。同时,还用这些糖蛋白结合疫苗免疫小鼠,通过单克隆抗体技术制备获得了针对Hib表面荚膜寡聚糖的单克隆抗体,鉴定了该单克隆抗体的亚型,并在体外检测了单克隆抗体识别和杀伤Hib细菌的能力。试验结果表明,合成的三种糖缀合物中,Nona-KLH的免疫效果较其它两种糖缀合物强,经过四次免疫之后,小鼠产生了很高的抗体滴度,特别是具有保护作用的IgG1免疫球蛋白,以及T细胞依赖型的免疫反应。抗血清与Hib细菌的结合试验显示,抗血清可以与Hib10211细菌进行特异性结合。用Nona-KLH对小鼠进行免疫后,通过单克隆抗体技术制备获得了一种抗原特异性的单克隆抗体,对其进行抗体亚型分析以及SDS-PAGE、Western blot等分析的结果均显示该抗体为IgM亚型。体外杀菌实验表明,在补体存在的条件下,该单克隆抗体可以介导明显的补体依赖型“杀菌”效果。本研究证实了合成的多聚核糖基核糖醇磷酸酯重复片段的寡聚体与载体蛋白所形成的缀合物可以诱导有效的免疫反应,从而为研发新型的Hib糖疫苗提供了思路与方法；同时,所获得的可有效识别Hib细菌的单克隆抗体有可能为Hib感染的早期诊断提供新的手段。
【关键词】：B型流感嗜血杆菌 合成疫苗 免疫反应 单克隆抗体 杀菌能力
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R392
【目录】：

• 摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 符号说明11-13
• 第一章 绪论13-26
• 1.1 糖13-14
• 1.2 糖药物14-15
• 1.3 糖疫苗15-16
• 1.4 糖疫苗的免疫机理16-17
• 1.5 Hib病原学17-18
• 1.6 Hib流行病学特点18-19
• 1.7 Hib疫苗的发展19-21
• 1.7.1 Hib荚膜多糖疫苗19-20
• 1.7.2 Hib结合疫苗20-21
• 1.7.2.1 PRP-D结合疫苗20
• 1.7.2.2 Hb-OC结合疫苗20-21
• 1.7.2.3 PRP-OMP结合疫苗21
• 1.7.2.4 PRP-T结合疫苗21
• 1.8 其他Hib疫苗的发展21-22
• 1.9 单克隆抗体技术22-23
• 1.10 单克隆抗体的应用23-24
• 1.11 本研究的目的和意义24-26
• 第二章 半合成Hib糖结合疫苗的免疫学评价26-40
• 2.1 引言26-27
• 2.2 材料27-30
• 2.2.1 细菌菌株,疫苗,小鼠27
• 2.2.2 主要试剂以及耗材27
• 2.2.3 主要仪器27-28
• 2.2.4 主要试剂的配制28-30
• 2.2.4.1 Elisa相关试剂的配制28-29
• 2.2.4.2 Hib细菌培养的相关试剂29-30
• 2.3 实验方法30-33
• 2.3.1 流感嗜血杆菌糖蛋白疫苗的合成30
• 2.3.2 动物免疫30
• 2.3.3 Elisa法检测血清中抗体滴度30-31
• 2.3.4 Hib细菌的培养31
• 2.3.5 Hib细菌的鉴定31-32
• 2.3.5.1 革兰氏染色31-32
• 2.3.5.2 生化检定32
• 2.3.5.3 生长因子检定32
• 2.3.6 Hib细菌菌库的建立32
• 2.3.7 Hib生长曲线的测定32-33
• 2.3.8 抗血清与细菌的结合能力检测33
• 2.4 结果与讨论33-38
• 2.4.1 疫苗的免疫效果33-34
• 2.4.2 Hib细菌的培养结果34-35
• 2.4.3 Hib细菌的鉴定35-37
• 2.4.3.1 革兰氏染色结果35-36
• 2.4.3.2 生化检定结果36
• 2.4.3.3 生长因子检定实验36-37
• 2.4.3.4 Hib细菌生长曲线的测定37
• 2.4.4 抗血清与细菌的结合实验37-38
• 2.5 小结38-40
• 第三章 单克隆抗体的制备以及体外杀菌活性研究40-60
• 3.1 引言40
• 3.2 实验材料40-43
• 3.2.1 实验细胞及动物40
• 3.2.2 试验试剂及耗材40-41
• 3.2.3 主要仪器及其型号41
• 3.2.4 主要试剂的配制41-43
• 3.2.4.1 细胞培养相关试剂的配制41
• 3.2.4.2 SDS-PAGE缓冲液41-43
• 3.2.4.3 Western blot相关试剂配制43
• 3.2.4.4 多聚赖氨酸溶液配制43
• 3.3 实验方法43-51
• 3.3.1 小鼠骨髓瘤细胞的培养43-45
• 3.3.1.1 细胞的冻存43-44
• 3.3.1.2 细胞复苏44
• 3.3.1.3 细胞传代44
• 3.3.1.4 细胞收集与计数44-45
• 3.3.2 单克隆抗体的制备45-47
• 3.3.2.1 加强免疫45
• 3.3.2.2 脾细胞的制备45
• 3.3.2.3 小鼠骨髓瘤细胞的准备45-46
• 3.3.2.4 细胞融合46
• 3.3.2.5 杂交瘤细胞的筛选46-47
• 3.3.2.6 杂交瘤细胞的克隆化47
• 3.3.3 杂交瘤细胞的染色体分析47-48
• 3.3.4 单克隆抗体分型试剂盒检测所得单克隆抗体的亚型48
• 3.3.4.1 样品准备与处理48
• 3.3.4.2 抗体分型检测48
• 3.3.5 单克隆抗体的大量制备48-49
• 3.3.6 单克隆抗体抗体亚型的验证49-50
• 3.3.6.1 SDS-PAGE检测49
• 3.3.6.2 Western blot49-50
• 3.3.7 单克隆抗体的“杀菌力”实验50-51
• 3.3.7.1 细菌菌落形成单位(CFU)的确定50
• 3.3.7.2 腹水中IgM“杀菌”力实验50-51
• 3.4 实验结果与讨论51-59
• 3.4.1 制备单克隆抗体的实验结果51-52
• 3.4.2 杂交瘤细胞染色体分析结果52-53
• 3.4.3 单克隆抗体亚型鉴定结果53-54
• 3.4.4 大量制备单克隆抗体结果54
• 3.4.5 单克隆抗体抗体亚型的验证结果54-59
• 3.4.5.1 SDS-PAGE实验结果54-55
• 3.4.5.2 Western blot实验结果55-57
• 3.4.5.3 细菌菌落形成单位(CFU)的确定57
• 3.4.5.4 腹水中IgM抗体的“杀菌”活性57-59
• 3.5 小结59-60
• 全文总结60-62
• 参考文献62-67
• 致谢67-68
• 攻读硕士期间发表的学位论文68-69
• 学位论文评阅及答辩情况表69

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 钟细苟,段载金,康治雄;猪瘟单克隆抗体诊断技术的推广应用[J];中国兽医科技;1999年12期

  本文关键词：B型流感嗜血杆菌寡糖缀合物疫苗的免疫活性研究相关单克隆抗体的制备，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：270593