皮下免疫磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）对小鼠肺炎链球菌感染的保护效果和机制研究

发布时间：2020-06-16 15:14

【摘要】：目的:肺炎链球菌磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是糖酵解途径中发挥关键作用的酶。近年来的研究发现GAPDH不仅存在于细菌的胞内也可以定位于细菌的表面,并且参与了其它的生理过程,如细胞凋亡、DNA修复及自噬。已有研究报道GAPDH在多种细菌中与细菌毒力密切相关,并且推测其可作为一个潜在的疫苗靶点。因此,本研究拟探索皮下免疫肺炎链球菌GAPDH对小鼠抵抗肺炎链球菌感染的保护效果,并进一步探索发挥免疫保护作用的机制,为肺炎链球菌蛋白疫苗的临床前研究提供依据。方法:利用原核表达重组技术制备重组GAPDH(rGAPDH)蛋白,采用镍柱纯化后去除内毒素(LPS),并通过细胞实验排除残留的LPS的干扰。实验组小鼠经皮下免疫rGAPDH及铝佐剂共四次,每次间隔两周,末次免疫后七天构建肺炎链球菌败血症模型和定植模型,通过测定生存率及鼻腔灌洗液和肺匀浆中的细菌载量来评价rGAPDH的保护效果。在体外实验部分,用rGAPDH处理骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)研究GAPDH发挥免疫保护作用相关的受体及信号通路。利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗原特异性抗体效价、抗体亚型以及细胞因子的表达。利用苏木精-伊红(HE)染色分析肺组织切片炎性改变。采用流式细胞术(FCM)分析BMDCs表面的共刺激分子以及细胞凋亡情况。用小分子抑制剂和Western blot分析rGAPDH激活BMDCs相关的信号通路。结果:成功制备GAPDH重组蛋白,经SDS-PAGE分析,纯度在90%以上。用鲎试剂检测残留LPS浓度显示低于0.1EU/ml,达到体内和体外实验要求。并且在体外的LPS排除实验中证实重组蛋白中残留的LPS不会影响后续实验。在体内实验中,我们发现用rGAPDH皮下免疫小鼠后,小鼠可以产生较高的抗原特异性抗体。在败血症模型中,实验组小鼠的生存率高于PBS对照组,有统计学差异;在定植模型中,实验组小鼠鼻腔灌洗液和肺匀浆中的细菌载量均显著低于PBS对照组。在体外试验中,我们发现rGAPDH可以引起BMDCs表面共刺激分子CD40、CD86和MHC II的高表达以及细胞因子IL-12p70、IL-6和TNF-α的释放增加,提示rGAPDH能够诱导BMDCs表型和功能的成熟。然而,用rGAPDH处理Toll样受体2(TLR2)和Toll样受体4(TLR4)缺陷鼠的BMDCs后,表面共刺激分子的表达和细胞因子水平与野生(WT)组相比显著地降低,提示rGAPDH可能通过TLR2和TLR4发挥作用。后续的研究表明rGAPDH可以激活MAPKs、PI3K-Akt和NF-κB的磷酸化,同时也可以上调mir-146a和下调mir-27a的表达。结论:1)肺炎链球菌GAPDH可以作为疫苗的候选蛋白;2)rGAPDH能够通过TLR2和TLR4激活BMDCs发挥免疫保护效应。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R378
【图文】：

肺炎链球菌,菌株

15图 1-1 肺炎链球菌不同菌株之间 GAPDH 氨基酸序列比较Fig 1-1 Multiple amino acid sequence alignment of GAPDH encoded by different kinds ofStreptococcus pneumoniae

肺炎链球菌,小鼠,重组蛋白,柱层析纯化

图 1-1 肺炎链球菌与小鼠和人的 GAPDH 氨基酸序列比较Fig 1-1 Multiple amino acid sequence alignment of GAPDH encoded by Streptococcuspneumoniae, mouse and huamn3.2 重组蛋白的制备3.2.1 重组蛋白 GAPDH 的表达及纯化在大肠杆菌中表达 rGAPDH，使用 Ni2 +电荷柱层析纯化，然后用 10％SDS-PAGE 分析。G-250 染色后，在分子量为 37KDa 处可见明显条带，并且其纯度高于 95％（图 2-1）。

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