成人Muse结胞分离、分化及定向诱导为Musc-NPCs的基础研究

发布时间：2017-03-28 14:13

  本文关键词：成人Muse结胞分离、分化及定向诱导为Musc-NPCs的基础研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的利用最新报道的干细胞—多系分化持续应激(Muse)细胞能向三个胚层分化的多能干细胞特性,从成人骨髓中分离Muse细胞,体外诱导为神经前体细胞(Muse-NPCs),建立一套简单方便的分离、分化、鉴定体系,为今后细胞治疗修复神经系统损伤提供新的种子细胞。方法 利用密度梯度离心法和差速贴壁法从健康成人骨髓中分离出人骨髓基质细胞(hBMSCs),免疫荧光细胞化学法和流式细胞仪技术对其进行鉴定；体外扩增后应用流式细胞分选技术从hBMSCs中分离出Muse细胞,长时间胰蛋白酶应激法鉴定其胰酶耐受性,CCK-8法和流式细胞仪技术对其细胞生物学特性进行检测,免疫荧光细胞化学法和qPCR技术检测其多能干细胞特性及向三胚层分化的能力;通过神经诱导培养基体外诱导Muse细胞分化为Muse-NPCs,免疫荧光细胞化学染色和qPCR技术鉴定其神经干细胞标记物表达情况,CCK-8法和流式细胞仪技术对其细胞生物学特性进行检测；运用慢病毒载体体外将荧光蛋白cherry转染至Muse-NPCs,使其带有红色荧光标记,为体内移植实验做准备。结果hBMSCs细胞表型呈 CD45-/CD11b-/CD90+。流式细胞分选技术从中成功分离出Muse细胞,免疫荧光细胞化学法鉴定其细胞表型为SSEA-3+/CD105+,悬浮培养时呈球状生长,生长状态良好、稳定,一定时间内处于持续增殖状态；胰蛋白酶孵育8h后,绝大部分Muse细胞生长状态稳定,胞体维持大而透亮的形态,免疫荧光细胞化学法和qPCR技术检测结果显示Muse细胞表达Nanog、Oct4、Sox2等多能干细胞标记物,且mRNA表达水平明显高于hBMSCs; Muse细胞贴壁后分化为不规则形态,免疫荧光细胞化学法和qPCR技术检测结果显示其分别表达三胚层标记物a-SMA、α-fetoprotein和NF-M。经神经诱导培养基诱导生成的Muse-NPCs呈干细胞球团状悬浮生长,免疫荧光细胞化学法和qPCR技术检测结果显示其表达神经干细胞标记物Nestin、NCAM和DCX,且mRNA表达水平明显高于hBMSCs-NPCs和Muse细胞；Muse-NPCs生长状态稳定,体外培养3d内增殖迅速,然后逐渐进入平台期；慢病毒载体包装荧光蛋白cherry体外转染Muse-NPCs,可见细胞自发红色荧光,荧光标记率达到95%以上,细胞状态良好。结论从成人骨髓中成功分离出Muse细胞,具有多能干细胞特性,生长状态稳定,体外成功诱导形成Muse-NPCs,具有神经干细胞特性,并标记红色荧光蛋白cherry,为后续体内实验做好准备。
【关键词】：骨髓基质细胞 Muse细胞 神经前体细胞 多能干细胞标记物 胰蛋白酶 转染
【学位授予单位】：南通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R329.2
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 第一章 绪论11-15
• 1.1 课题来源、研究的目的和意义11
• 1.2 国内外研究概况11-14
• 1.3 论文的主要研究内容14-15
• 第二章 材料与方法15-34
• 2.1 实验材料15-19
• 2.1.1 细胞来源15
• 2.1.2 实验试剂及溶液的配制15-18
• 2.1.3 实验耗材及仪器18-19
• 2.2 实验流程和方法19-34
• 2.2.1 hBMSCs的分离、培养和传代19
• 2.2.2 hBMSCs的体外诱导19-20
• 2.2.3 Muse细胞的分选、培养和分化20-22
• 2.2.4 Muse细胞的体外定向诱导22
• 2.2.5 ESCs的培养22-24
• 2.2.6 流式细胞仪检测hBMSCs表型24
• 2.2.7 免疫荧光细胞化学技术24-26
• 2.2.8 CCK-8法检测细胞增殖活力26
• 2.2.9 细胞周期的检测26-27
• 2.2.10 活细胞工作站的应用27-28
• 2.2.11 qPCR检测28-32
• 2.2.12 Muse-NPCs的荧光蛋白cherry转染32-33
• 2.2.13 统计学分析33-34
• 第三章 结果34-56
• 3.1 hBMSCs的分离、培养及鉴定34-38
• 3.1.1 hBMSCs的分离及培养34-36
• 3.1.2 hBMSCs的鉴定36-38
• 3.2 Muse细胞的分离及培养38-40
• 3.3 Muse细胞的鉴定40-49
• 3.3.1 Muse细胞的细胞表型鉴定40-41
• 3.3.2 Muse细胞的细胞生物学特性检测41-43
• 3.3.3 Muse细胞胰酶应激耐受能力的鉴定43-44
• 3.3.4 Muse细胞的多能干细胞特性的鉴定44-46
• 3.3.5 Muse细胞向三个胚层分化能力的鉴定46-49
• 3.4 体外诱导Muse细胞分化成Muse-NPCs49-54
• 3.4.1 Muse-NPCs的定向诱导分化49-50
• 3.4.2 Muse-NPCs的鉴定50-54
• 3.5 Muse-NPCs的荧光蛋白cherry转染54-56
• 3.5.1 Muse-NPCs的荧光蛋白cherry转染预实验54-55
• 3.5.2 Muse-NPCs的荧光蛋白cherry转染正式实验55-56
• 第四章 讨论56-60
• 第五章 结论60-61
• 参考文献61-65
• 英文缩写词表65-67
• 综述67-90
• 综述参考文献83-90
• 在攻读硕士学位期间参加的项目及发表的论文90-91
• 致谢91

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 薛群,苗宗宁,华军,曲静,王明元,金钧,施勤,陈永井,方振羊,惠国桢,张学光;骨髓间充质干细胞体外趋化神经前体细胞的机制[J];细胞生物学杂志;2005年02期

2 庄菁,曾园山,罗超权,李海标;神经前体细胞的分离培养及绿色荧光蛋白基因的转染[J];中山医科大学学报;2001年05期

3 栗超跃;神经前体细胞迁移研究现状[J];国外医学.神经病学神经外科学分册;2002年04期

4 徐波涛,周晓平,钱国正;大鼠中脑神经前体细胞的分离鉴定和培养[J];中国微侵袭神经外科杂志;2004年07期

5 阮奕文,谢瑶,王传恩,姚志彬;体外培养获取高纯度神经前体细胞[J];解剖学研究;2000年01期

6 罗燕,唐仕波,姚志彬;永生化神经前体细胞及其应用[J];神经解剖学杂志;2001年01期

7 贡志刚,黄强,兰青;小胎龄鼠的腹侧中脑神经前体细胞体外培养研究[J];中国微侵袭神经外科杂志;2004年04期

8 李荣荣;陈洪伟;陈栋梁;王淑芬;张敬;陈锐;季维智;;肝细胞生长因子促进猕猴胚胎干细胞来源的神经前体细胞的增殖[J];动物学研究;2008年05期

9 丁英,曾园山,郭家松,李海标,陈穗君;施万细胞对植入半横断脊髓内的神经前体细胞存活及分化的影响[J];解剖学报;2002年01期

10 吴迪;岳峰;关云谦;张愚;;食蟹猴脑室下区成体神经前体细胞培养及鉴定[J];中华神经医学杂志;2006年06期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 朱晓音;曹伟鹏;王辉;辛华;;酒精对神经前体细胞增殖的抑制作用及信号通路探讨[A];中国细胞生物学学会医学细胞生物学学术大会论文集[C];2006年

2 梅爱农;张苏明;黎逢光;常丽英;梁燕玲;;胚胎干细胞源性神经前体细胞的免疫原性[A];第九次全国神经病学学术大会论文汇编[C];2006年

3 张海燕;赵咏梅;赵春礼;段德义;徐群渊;;端粒酶永生化人胚胎纹状体神经前体细胞特性研究[A];中国细胞生物学学会2005年学术大会、青年学术研讨会论文摘要集[C];2005年

4 王晓梅;赵永波;刘文文;呙登俊;;正常成人脑海马区多潜能神经前体细胞的体外分离鉴定[A];中国神经科学学会第六届学术会议暨学会成立十周年庆祝大会论文摘要汇编[C];2005年

5 孙涛;张道来;辛华;;体外贴壁和悬浮培养大鼠胚胎脑神经前体细胞生物学特性研究[A];第二届中国医学细胞生物学学术大会暨细胞生物学教学改革会议论文集[C];2008年

6 冯锦丽;高天明;;成年大鼠海马神经前体细胞表达功能性L-型钙通道[A];中国神经科学学会第六届学术会议暨学会成立十周年庆祝大会论文摘要汇编[C];2005年

7 胡智兴;梁道明;吴兰鸥;郑春兰;陶剑;罗海云;;肝细胞生长因子对胚胎干细胞来源的神经前体细胞氧化应激损伤的保护[A];第七届海峡两岸心血管科学研讨会论文集[C];2009年

8 吴丽丽;冉川莲;严灿;刘书考;潘毅;;海马神经前体细胞的体外培养鉴定及皮质酮对其增殖的影响[A];第九届中国中西医结合实验医学学术研讨会论文汇编[C];2009年

9 张京钟;余爽;赵春礼;徐群渊;;过表达Nurr1基因神经前体细胞诱导分化为多巴胺能神经元[A];中国神经科学学会第六届学术会议暨学会成立十周年庆祝大会论文摘要汇编[C];2005年

10 马杰;杨敏;江峰;杨建华;王裕;;胚胎干细胞移植对缺氧缺血性脑损伤海马的影响[A];《中华急诊医学杂志》第五届组稿会论文汇编[C];2006年

中国重要报纸全文数据库 前3条

1 ;单唾液酸四己糖神经节苷脂诱导成年大鼠骨髓基质细胞成为神经前体细胞及其分化作用的研究[N];中国医药报;2003年

2 记者 刘霞;老鼠皮肤细胞可直接转化为神经前体细胞[N];科技日报;2012年

3 ;无糖对体外培养的神经前体细胞损伤的影响[N];中国医药报;2003年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 迟连凯;人多能干细胞定向分化为腹侧神经前体细胞和相应神经元亚型的研究[D];郑州大学;2016年

2 李怡;极低频电磁场对中脑神经前体细胞分化的作用及其机制研究[D];第二军医大学;2003年

3 王彩英;丙戊酸钠对人海马神经前体细胞分化和凋亡的影响及作用机制[D];苏州大学;2010年

4 金璐;神经营养因子-3和成纤维生长因子-2在神经前体细胞增殖和分化中的相互作用及其机制研究[D];中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）;2005年

5 杨彩侠;Desert Hedgehog诱导大鼠胚胎中脑神经前体细胞定向分化的研究[D];河北医科大学;2009年

6 陈阳;声刺激诱导大鼠嗅球神经前体细胞向耳蜗核迁移、分化的研究[D];第四军医大学;2007年

7 冯树梅;小鼠胚胎干细胞来源神经前体细胞的移植研究及兔脾成纤维样细胞的多功能性研究[D];浙江大学;2008年

8 张振兴;诱导成人成肌细胞转化为神经前体细胞及用于移植治疗局灶性脑缺血的实验研究[D];中国协和医科大学;2006年

9 赖晨;Neuregulin在调节神经前体细胞增殖以及少突胶质细胞分化过程中的相关机制[D];中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）;2004年

10 贾德永;c-Abl在高糖诱导胚胎神经前体细胞凋亡中的作用及作用机制的研究[D];山东大学;2008年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 马艳霞;GPR50通过调控Notch和Wnt/β-catenin信号通路促进神经前体细胞的自我更新与神经元分化[D];苏州大学;2015年

2 牛学英;成人Muse结胞分离、分化及定向诱导为Musc-NPCs的基础研究[D];南通大学;2015年

3 陶玉慧;神经前体细胞在成年小鼠脊髓的分布特征[D];南昌大学;2008年

4 王辉;酒精对神经前体细胞损伤及其机制研究[D];山东大学;2007年

5 刘智全;不同接种密度培养胎鼠脊髓神经前体细胞的实验研究[D];大连医科大学;2008年

6 姚先进;人胎脑源性神经前体细胞致瘤性评价[D];安徽医科大学;2014年

7 龚芝;甘氨酸受体α2亚型对成年神经前体细胞增殖的影响[D];南方医科大学;2008年

8 朱晓音;酒精对神经前体细胞的作用及细胞内信号通路的影响[D];山东大学;2006年

9 宋嵬;大鼠外周神经节内神经前体细胞的观察[D];东南大学;2006年

10 王大炜;低浓度毒死蜱对神经前体细胞和端脑发育的影响[D];浙江工业大学;2015年

  本文关键词：成人Muse结胞分离、分化及定向诱导为Musc-NPCs的基础研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：272422