miR-155在低氧环境中对间充质干细胞免疫因子表达的调控及其机制研究

发布时间：2017-03-28 15:18

  本文关键词：miR-155在低氧环境中对间充质干细胞免疫因子表达的调控及其机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:探讨miR-155在低氧条件下对人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的增殖、周期和免疫因子表达的调控以及作用机制。方法:将剔除脐动静脉及脐外膜的新鲜人脐带剪切成小组织块,用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养,得到贴壁细胞。倒置相差显微镜观察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面抗原及细胞周期,CCK-8法进行细胞增殖情况的检测。通过Lip2000,将mi R-155 mimic、mimic NC转染至hUC-MSCs中,构建miR-155高表达的hUC-MSCs。在氯化钴(CoCl2)模拟的化学低氧环境中,用脂多糖(LPS)刺激hUC-MSCs的免疫作用,将实验设置为六组,①空白对照组为未转染的hUC-MSCs、②LPS对照组、③mi R-155 mimic-NC+LPS组、④miR-155 mimic+LPS组、⑤低氧+miR-155 mimic-NC+LPS组、⑥低氧+miR-155 mimic+LPS组。采用实时荧光定量-PCR方法鉴定其转染效果,并检测免疫相关基因IL-6、IL-8、iNOS、SDF-1?、TGF-β、HIF-1α的表达。ELISA法检测上清中分泌的细胞因子IL-6、IL-8、TGF-β及SDF-1α,Western blot法检测相关蛋白iNOS、HIF-1α的表达。结果:体外培养7~10 d后,有细胞从组织块中爬出;提取并培养扩增的hUC-MSCs形态一致,外观呈纺锤形或梭形成纤维细胞样;流式细胞仪周期检测结果显示,G0/G1期的细胞数超过80%;生长曲线显示其增殖能力强;流式检测hUC-MSCs表面相关抗原CD29、CD73、CD90、CD105表达阳性,CD31、CD14、CD34、CD45、CD11b、HLA-DR呈阴性表达。CoCl2模拟的化学性低氧可促进hUC-MSCs增殖,且具有一定时间及浓度相关性。Mi R-155转染有效(P0.05),mi R-155高表达组的细胞因子IL-8、IL-6表达上调,iNOS基因及蛋白的表达均下调,且低氧环境下HIF-1α基因及蛋白表达增多,并可促进miR-155的调节作用,均具有统计学意义(P0.05);而mi R-155对细胞因子SDF-1α、TGF-β的表达无明显影响,不具有统计学意义(P0.05)。结论:分离获取的hUC-MSCs,能在体外培养、扩增,可作为组织工程种子细胞来源。CoCl2模拟的体外低氧坏境能促进hUC-MSCs增殖,最佳浓度为200μmol/L,但过高浓度(250μmol/L)时反而抑制其增殖。低氧条件通过上调HIF-1α的表达,从而下调i NOS蛋白,由此促进miR-155负向调控hUC-MSCs的免疫抑制能力。
【关键词】：间充质干细胞 低氧 微小RNA-155 诱导型一氧化氮合酶 乏氧诱导因子-1α
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R392.12
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-7
• 英文缩略词7-10
• 第一章 前言10-13
• 第二章 材料与方法13-28
• 2.1 材料13-15
• 2.1.1 组织13
• 2.1.2 主要试剂13-14
• 2.1.3 主要仪器设备14-15
• 2.1.4 实验室配制溶液15
• 2.2 方法15-28
• 2.2.1 细胞提取及培养15-18
• 2.2.2 细胞增殖实验及表型鉴定18-19
• 2.2.3 细胞干预及转染19-20
• 2.2.4 实时荧光定量反转录-聚合酶链反应20-24
• 2.2.5 Western blot24-28
• 2.2.6 ELISA28
• 2.2.7 统计分析28
• 第三章 结果28-36
• 3.1 所提取hUC-MSCs的形态学观察28-29
• 3.2 所提取hUC-MSCs的增殖能力及表面抗原分析29-30
• 3.2.1 所提取hUC-MSCs的生长曲线分析29-30
• 3.2.2 所提取hUC-MSCs的细胞表面抗原特性30
• 3.2.3 所提取hUC-MSCs的细胞周期分析30
• 3.3 氯化钴模拟化学低氧的浓度选择结果30-33
• 3.3.1 CoCl_2对hUC-MSCs增殖能力的影响30-32
• 3.3.2 CoCl_2对hUC-MSCs细胞周期的影响32-33
• 3.4 MiR-155转染效率的分析结果33
• 3.5 RT-qPCR法检测各组hUC-MSCs中IL-6、IL-8、iNOS、SDF-1、TGF-β、HIF-1α m RNA的表达情况33-34
• 3.6 Western blot法检测各组MSCs中i NOS及HIF-1α 蛋白的表达情况34-35
• 3.7 ELISA法检测各组hUC-MSCs上清中IL-6、IL-8、SDF-1、TGF-β 细胞因子的表达情况35-36
• 第四章 讨论36-40
• 4.1 人脐带源性MSCs的分离与鉴定36
• 4.2 氯化钴模拟低氧环境对hUC-MSCs的研究36-37
• 4.3 Mi R-155在hUC-MSCs中的研究37-38
• 4.4 Mi R-155在低氧环境中对hUC-MSCs的研究38-40
• 第五章 结论40-41
• 5.1 结论40
• 5.2 研究缺陷与展望40-41
• 参考文献41-45
• 综述45-52
• 参考文献49-52
• 在学期间的研究成果52-53
• 致谢53

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  本文关键词：miR-155在低氧环境中对间充质干细胞免疫因子表达的调控及其机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

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