人博卡病毒结构蛋白5’UTR调控mRNA生成及可变翻译的研究

发布时间：2020-06-22 01:22

【摘要】：2005年,研究者从急性呼吸道感染的幼儿患者鼻黏提取物中分离并鉴定出一种新的病毒,命名为人博卡病毒(Human bocavirus,HBoV)。人博卡病毒是继B19后第二种与人类疾病相关的细小病毒,同时也是细小病毒科博卡病毒属中牛细小病毒(BPV)和犬细小病毒(MVC)之外第三个成员(1,2)。人博卡病毒共有四个亚型,本研究中所研究的是I型,即HBoV1。HBov1感染引发呼吸道相关疾病,但是其致病机理至今仍未阐明。HBoV1是单链DNA病毒,基因组大小约为5.5kb,末端重复序列形成发卡结构。病毒的mRNA均由P5起东西进行转录,经RNA可变剪接与加工,形成成熟的mRNA,主要编码非结构蛋白NS1-4及NS1-70,博卡病毒属特有蛋白NP1,以及结构蛋白VP1、VP2和VP3。VP1作为质量最大的结构蛋白,其N端的129个氨基酸残基被称为VP1特有序列(VP1 unique sequence,VP1u),具有A2磷酸酶活性,对病毒入侵细胞起到重要作用。VP3作为最小的结构蛋白,是衣壳的主要组成部分。病毒粒子中VP1/2/3的含量比例约为1:1:10,主要由转录子R6,R7,R8编码。由于VP1/2/3共享C端氨基酸序列,其编码序列部分重叠,HBoV1如何调控翻译过程,使得编码框位于下游的VP3蛋白表达水平显著高于VP1蛋白?这种调控过程对于HBoV1的病毒生命周期又产生怎样的影响?HBoV1结构蛋白的可变翻译对于病毒的整个生命周期的影响及其分子机制,是本研究需要解决的核心科学问题。本研究通过同位素标记的体外共转录与翻译实验证明了HBoV1结构蛋白存在可变翻译现象。含有vp1基因的转录结构是多顺反子,能够同时翻译出VP1/2/3三个结构蛋白,且5’UTR序列对于蛋白的翻译具有调控作用。并且通过实验证明,5’UTR是HBoV1结构蛋白VP1/2/3在真核细胞HEK293T内表达所必需的序列,不仅影响着结构蛋白的翻译效率,同时也对结构蛋白RNA的转录起到促进作用。由于真核细胞的5’UTR中存在多样化的调控元件,影响着下游基因的翻译水平。本研究构建了双荧光报告载体用以验证5’UTR及VP1u中是否含有能够介导VP3表翻译的中间核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES),排除了IRES参与VP1/2/3可变翻译的可能。同时,我们证明VP1/2/3的可变翻译是一个由上游开放阅读框(upstream open reading frame,uORF)介导的核糖体扫描渗透过程。uORF不仅在翻译层面上调控VP1/2/3的可变翻译,同时也在转录水平上影响HBoV1的RNA剪接与加工过程。本研究在HBoV1感染性克隆上针对性的突变uORF的起始密码子序列,发现uATG的突变并不影响HBoV1感染性克隆转染后病毒基因组复制水平,但是uATG23的突变显著改变VP1/2/3的翻译比例,增加了VP1的翻译效率,同时也影响子代病毒的生成,对HBoV1的生命周期起到至关重要的影响作用。此外,通过逐步截短5’UTR序列,本研究鉴定出HBoV1的R6转录子5’UTR中存在决定结构蛋白RNA丰度的顺式作用元件,是5’UTR中除开uORF之外的一个影响病毒RNA转录水平的调控元件。本研推进了目前对于人博卡病毒结构蛋白的研究进展,为人博卡病毒的防治提供了新的理论支撑。
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院武汉病毒研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R373
【图文】：

图 1.1 HBoV1 基因组结构示意图及转录图谱。基因组末端具有回文序列，形成发卡结构。左末端的回文序列部分对称，形成兔耳朵形态的二级结构。右末端的回文结构完全对称，形成标准的发卡结构。病毒基因组含有 3 个(pA)p 位点以及 2个(pA)d 位点，4 个可变剪接供体位点（D1，D1’，D2 和 D3），4 个可变剪接受体位点（A1，A1’，A2，A3）。HBoV1 通过 P5 启动子转录，转录出的 pre-mRNA在这些位点选择性的进行 RNA 剪接以及添加 poly(A)尾巴，形成成熟的 mRNA，4

图 1.2 真核生物经典帽子依赖的核糖体扫描翻译起始模型(46-50)。核糖体 40S 亚基、甲硫氨酰 tRNA、GTP 以及真核翻译起始因子 2 形成的四聚体通过真核翻译起始因子招募到 mRNA 的 m7G 帽子结构上，形成 43S 的翻译起始复合体前体，并在 mRNA 的 5’UTR 上进行扫描，直至遇到合适的翻译起始位点。核糖体 60S亚基在eIF5B水解GTP的帮助下，加入PIC复合体，随后真核翻译起始因子释放，形成翻译起始复合体并往下游延伸，进行蛋白的翻译。Figure 1.2 Canonical eukaryotic cap-dependet translation initation (46-50). eIFs,eukaryotic initiation factors. 40S, 40S ribosome subunit. 60S, 60S ribosome subunit.PABP, poly(A) binding protein. 5’UTR, 5’ untranslated region. 3’UTR, 3’untranslated region.绝大多数的真核细胞 mRNA 属于单顺反子转录子，在其翻译起始位点之前没有额外的 AUG 起始密码子。在 Kozak 构建的翻译起始核糖体扫描模型中，核

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本文编号：2724960