小鼠视网膜光损伤模型中Fra-2的表达及作用机制研究

发布时间：2020-06-23 07:43

【摘要】：背景:随着科学技术的迅速发展,人工照明设备的使用范围不断扩大,光污染也成为危害人类身体健康的危险因素之一。环境中过量的光照射眼睛会诱导视网膜发生损伤。且在一些常见的视网膜退行性眼科疾病中,如年龄相关的黄斑变性(Age related macular degeneration,AMD)以及视网膜色素变性(Retinitis pigmentosa,RP)等与视网膜光损伤的病理形态改变相似,因此,视网膜光损伤模型是研究许多眼科疾病的良好模型。既往对小鼠视网膜光损伤模型研究中证实fra-2发挥原癌基因作用,即上调Fra-2蛋白表达引起小鼠眼睛发育异常。分子量为46 kDa的Fra-2蛋白是转录激活蛋白1(Activator protein 1,AP-1)蛋白家族的成员之一,有并由c-fos和c-jun两个原癌蛋白基因组成。我们考虑在视网膜光损伤过程中Fra-2是否有参与及其作用机制。细胞内强烈的应激反应会引起DNA的损伤,从而诱发各种胞内反应,包括DNA修复、细胞周期阻滞以及细胞凋亡等,严重的DNA损伤会导致DNA修复失败,最终引起细胞凋亡。研究已经证实细胞核DNA的损伤可以迅速的激活多聚ADP核酶1(Poly(ADP-ribose)polymerase 1,PARP-1),并促进ADP与PARP-1和其他核蛋白如组蛋白、拓扑异构酶的聚合。凋亡诱导因子(Apoptosis inducing factor,AIF)作为线粒体氧化还原酶,具有催化细胞色素C和烟酰胺腺嘌呤而核苷酸(NAD)之间电子传递的作用,且PARP-1的过度激活会诱导细胞合成大量的PAR,从而促进AIF从线粒体释放并转移到细胞核中,从而激活细胞凋亡信号通路。本研究通过建立小鼠光损伤模型以及体外细胞实验探究Fra-2基因在视网膜光损伤中的可能作用机制。第一部分强光暴露对小鼠视网膜的损伤研究目的:通过建立小鼠视网膜光损伤模型,探究2600 Lux可见光暴露对小鼠视网膜的影响。方法:将小鼠放置在光照强度为2600 Lux的光照箱中饲养36 h建立小鼠视网膜光损伤模型。应用HE染色观察小鼠视网膜组织损伤情况,使用western blot检测小鼠视网膜中PARP-1、Fra-2以及凋亡相关蛋白(Cyt-c、Bax、Blc-2、Bcl-xL)的表达水平。结果:本研究结果表明,2600 Lux可见光暴露12 h以后,小鼠视网膜组织出现明显损伤,具体表现为小鼠视网膜内核层和外核层明显变薄,组织的裂解和细胞溶解,光感受器细胞外节段排列紊乱,神经节细胞层出现凋亡;小鼠视网膜中两种促进凋亡相关蛋白Cyt-c和Bax的表达从光暴露12 h开始均出现显著性的上升,且两种抑制凋亡的蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表达从光暴露12 h开始均出现显著性的下降;小鼠视网膜中PARP-1和Fra-2的蛋白水平在光暴露6h-36h以后逐渐显著升高。结论:这些研究证实经过2600 Lux强光暴露12 h以后,小鼠视网膜组织出现明显损伤;暴露36h后,小鼠视网膜受到强烈的损伤以及引起视网膜光感受器细胞凋亡,且Fra-2和PARP-1参与光诱导视网膜损伤中细胞凋亡的调节。第二部分过表达或者干扰表达Fra-2对RGC-5细胞的影响目的:探索过表达或干扰表达Fra-2基因对RGC-5细胞的影响方法:使用Far-2基因过表达或干扰质粒转染正常RGC-5细胞,使用免疫荧光实验检测质粒转染情况,western blot检测相关蛋白的表达,MTT实验检测细胞增殖活性,流式细胞技术检测细胞凋亡情况。结果:免疫荧光检测以及western blot检测证实Fra-2基因过表达/干扰质粒转染RGC-5细胞模型建立成功;过表达Fra-2基因显著抑制RGC-5细胞的增殖活性以及诱导RGC-5细胞凋亡率的升高;过表达Fra-2基因显著提高了 RGC-5细胞中PARP-1的蛋白表达,以及促进AIF从细胞质向细胞核的转移。结论:在正常RGC-5细胞中过表达Fra-2基因可以抑制细胞增殖活性以及诱导细胞凋亡,且PARP-1/AIF信号途径参与Fra-2过表达诱导的RGC-5细胞损伤。第三部分干扰Fra-2表达对光诱导RGC-5细胞损伤的影响目的:探究干扰Fra-2的表达对2600 Lux可见光暴露诱导RGC-5细胞损伤的影响方法:使用Fra-2干扰质粒siFra-2转染RGC-5细胞,并与2600Lux可见光暴露下培养72h(siFra-2+LE),以正常培养细胞作为正常对照组(Control group,CON)、不转染干扰质粒但可见光暴露的细胞作为阴性对照组(Light exposure group,LE)、采用PARP-1抑制剂NU1025处理可见光暴露的RGC-5细胞作为阳性对照(NU1025+LE),应用流式细胞技术检测细胞凋亡,MTT实验进行细胞增殖活性检测,western blot检测PARP-1/AIF信号途径蛋白表达情况。结果:与正常对照组细胞相比,2600Lux可见光暴露后RGC-5细胞的凋亡率显著上升且细胞增殖活性受到显著的抑制;与光暴露组相比,转染Fra-2干扰质粒的RGC-5细胞经过可见光暴露后,细胞凋亡率显著下降且细胞的增殖活性显著升高;与正常对照组相比,可见光暴露以后细胞中PARP-1的蛋白水平显著升高,且AIF由细胞质向细胞核内转移;与可见光暴露组相比,转染干扰质粒的RGC-5细胞中PARP-1的蛋白水平显著下降,且AIF由细胞质向细胞核内的转移也显著受到抑制。结论:干扰Fra-2的蛋白表达通过抑制RGC-5细胞内PARP-1的合成释放,以及降低RGC-5细胞质中AIF向核内的转移,减轻可见光暴露诱导的RGC-5细胞损伤。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R774.1;R-332
【图文】：

１．２结果逡逑１．２．１邋ＨＥ染色观察光暴露对小鼠视网膜的损伤情况逡逑小鼠在２６００邋Ｌｕｘ光照强度暴露后，视网膜组织的ＨＥ染色结果如图１－１所示。逡逑随着光照暴露时间的延长，持续光照暴露１２邋ｈ以后小鼠的视网膜遭受严重破坏，逡逑主要损伤出现在内核层和神经节细胞层，表现为组织的裂解和细胞溶解。光照暴逡逑露１２邋ｈ以后，小鼠视网膜内核层和外核层明显变薄，出现组织溶解，光感受器逡逑细胞外节段排列紊乱，神经节细胞层出现凋亡。对照组小鼠视网膜结构正常且单逡逑层排列紧密，各层次贴合良好，组织无明显溶解和脱落。光暴露６邋ｈ组小鼠视网逡逑膜结构正常，与对照相比无明显变化。逡逑对照组逦光照６邋ｈ逡逑＿＿逡逑光照１２邋ｈ逦光照２４邋ｈ逦光照３６邋ｈ逡逑图１．１邋ＨＥ染色观察持续光照对小鼠视网膜组织结构的损伤（４００Ｘ）逡逑１８逡逑

逡逑图１．２＼￥。５１６１１＾１0１：检测小鼠视网膜组织中＃常蕖ⅲ海福Γ堋ⅲ海福ǎ唬保

本文编号：2727018