HIV-1体液免疫评价方法的建立与应用
发布时间：2020-06-25 13:15
【摘要】：自1983年确定HIV为获得性免疫缺陷综合征的病原体以来,艾滋病的流行给全球的经济、卫生和社会稳定带来了巨大影响,已成为重大的公共卫生和社会问题,引起世界卫生组织及各国政府的高度重视。研制成功的HIV疫苗是预防艾滋病最为有效的途径。由于HIV基因变异较大,流行毒株有地区差异,HIV的保护机制尚不明确,且没有发现一例自然清除HIV感染的病例,与保护相关的免疫学指标仍不是很清楚,使得HIV疫苗研发之路困难重重。普遍认为HIV-1中和抗体对预防HIV-1感染至关重要,HIV-1膜蛋白(Envelope,Env)位于病毒的表面,是HIV-1中和抗体作用的靶标。为评价我国HIV-1疫苗诱导的中和抗体,本实验室已从HIV-1感染者血浆中分离并构建了涵盖我国主要流行株CRF07/08_BC、CRF01_AE亚型Env假病毒。近期,本实验室构建了 28株B、B'亚型Env假病毒,包括15株B'亚型(B'_CN)和13株B亚型(B_CN),与来源于国外的18株B亚型假病毒(B EU)进行比较,发现国内外B亚型假病毒在env基因序列及对中和血浆的反应性等方面存在差异。为了进一步分析病毒对中和单抗的反应性,我们开展了三组共计46株假病毒(包括15株B'_CN、13株B_CN和18株B_EU),对可溶性CD4蛋白(sCD4)和16株广谱中和单抗(broadly neutralizingmonoclonalantibodies,bnmAbs)的中和特性研究。结果发现,B_CN 假病毒对sCD4的敏感性显著低于B_EU假病毒,提示我国的B亚型病毒暴露的CD4结合位点,与国外来源的病毒不同;识别Env三聚体顶端区的PGT145和CH01-04,有着相似的中和活性,它们中和B'_CN亚型假病毒的能力显著低于中和B_EU亚型假病毒的能力;识别gp41上的近膜胞外区(membrane-proximal external region,MPER)的2F5中和B'_CN亚型假病毒的能力显著高于中和B_EU亚型假病毒的能力,这些结果表明我国来源的B、B'假病毒有独特的中和表型;通过bnmAbs表位信息分析,发现B'_CN、B_CN与B_EU病毒在bnmAbs识别表位上氨基酸的差异可能是导致国内外病毒中和特性不同的原因。为提高国内HIV-1疫苗中和抗体检测水平,我们在国内9个从事HIV-1疫苗研究的实验室间,开展了基于TZM-bl细胞的假病毒中和抗体方法的协作标定。根据假病毒和血浆样品的中和特性,依据假病毒敏感性和血浆中和能力呈高、中、低的分布,选取了 10株B、B'、9株CRF01_AE亚型的假病毒、5份B、B'和5份CRF01_AE亚型的血浆作为本轮协作标定的样本。以实验室间至少80%的检测数据在判定范围内,为通过本轮协作标定的判定标准,结果显示6个实验室通过本轮协作标定;实验室间两两比对,检测结果在彼此的3倍范围内,认为检测结果一致,6个实验室间一致率达46.7%,相比第一轮的一致率37%略有提高,表明通过实验室间协作标定提高了国内实验室的检测能力,保证了实验室间检测结果的可比性。RV144疫苗临床试验显示该疫苗有一定的保护效果,研究表明V1V2结合抗体的水平与感染风险呈负相关,提示在HIV-1疫苗评价中有保护功能的非中和抗体不容忽视。本研究以 gp70(MLV)-V1V2(HIV-1/CN54)、gp70(MLV)-V1V2(HIV-1 CRF01_AE)为抗原,建立了检测V1V2结合抗体的间接ELISA方法,运用该方法检测了感染HIV-1不同亚型MSM队列血浆,结果显示,感染病人中V1V2抗体阳性率较高,且存在亚型间交叉反应,抗体出现后呈现持续阳性的态势。分析发现,HIV-1感染者体内V1V2抗体水平和CD4 T细胞数目无相关性;V1V2抗原性的差异可能与V1V2序列和糖基化的差异有关。本研究HIV-1 B、B'亚型对bnmAbs的中和特性分析,可为HIV-1 B、B'亚型免疫原的设计、疫苗评价等提供信息;实验室间协作标定评估了国内实验室的HIV-1中和抗体检测能力,提升了我国实验室间中和抗体检测结果的可比性;V1V2抗体检测方法的建立为后续HIV-1疫苗评价提供方法和技术支持。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392
【图文】：
ｇｐｌ２０上有５个可变区（Ｖ１－Ｖ５）和５个恒定区（Ｃ１－Ｃ５）邋［１９－２１］，可变区和恒逡逑定区相间排列，可变区由链间Ｃｙｓ残基形成的二硫键形成环状（ｌｏｏｐ），因此也被逡逑称为Ｖ１－Ｖ５环（Ｖｌ－Ｖ５邋１ｏｏｐ）（图１）。ＶＩ区的功能意义尚不明确，有研宄指出和逡逑野生型相比，ＶＩ区羧基末端发生突变会降低病毒合胞体的形成［２２］。Ｖ１Ｖ２区是氨逡逑基酸长度和糖基化位点变化最多的区域［２３－２７］，邋Ｖ３环和Ｃ２、Ｃ３和Ｃ４区长度变化逡逑相对较小。Ｃｕｒｌｉｎ等人分析了从１５４例临床病人分离的５１８５条ＨＩＶ－１邋ｇｐｌ２０核苷酸逡逑序列，发现Ｖ１Ｖ２区的长度和糖基化位点（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ邋Ｎ－ｌｉｎｋｅｄ邋ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ邋ｓｉｔｅ，逡逑ＰＮＬＧＳ）数会随着感染时间变化，并且Ｖ１Ｖ２长度的变化可能会促进病毒逃避宿主逡逑体液免疫反应［２８］。（：１、０３和＃辞鈌校0４受体结合域［２９－３１］。￥３环长度相对恒逡逑定，一般有３４－３５个氨基酸，但是氨基酸序列高度可变［２２］，其上有中和抗体识别逡逑７逡逑
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒ邋５，邋ＣＣＲ５）或邋ＣＸＣ邋趋化因子受体邋４邋（ＣＸＣ邋ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒ邋４，逡逑ＣＸＣＲ４）结合，导致病毒与靶细胞的融合，并将病毒的核心成分释放入靶细胞的细逡逑胞质内（图２）邋［４７］。逡逑ＨＩＶ－１包膜蛋白是中和抗体识别的主要靶点，目前已获得了近百种具有广谱中逡逑和性的单克隆抗体（ｂｒｏａｄ邋ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ邋ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ邋ａｎｔｉｂｏｄｙ，邋ｂｎｍＡｂ）邋［４８］，它们可以逡逑识别邋ｇｐｌ２０邋上的邋ＣＤ４邋结合位点（ＶＲＣ０１、ＮＩＨ４５－４６、１２Ａ１２、３ＢＮＣ１１７、ＶＲＣ－ＰＧ０４、逡逑ＶＲＣ－ＣＨ３１、ＶＲＣ１３、ＶＲＣ１６、Ｍ２、ＨＪ１６、ＶＲＣ０３、１Ｂ２５３０、８ＡＮＣ１３１邋等），Ｖ１／Ｖ２逡逑可变区（ＰＧ９、ＰＧ１６、ＣＨＯＩ、ＣＨ０２、ＣＨ０３、ＣＨ０４、ＰＧＴ１４１、ＰＧＴ１４２、ＰＧＴ１４３、逡逑ＰＧＴ邋１４４、ＰＧＴ１４５、２９０９邋等），Ｖ３邋区（ＰＧＴ１２１、ＰＧＴ１２８、２Ｇ１２、ＰＧＴ１２２、ＰＧＴ１２３、逡逑ＰＧＴ１２５、ＰＧＴ１２６、ＰＧＴ１２７、ＰＧＴ１２９、ＰＧＴ１３０、ＰＧＴ１３１、ＰＧＴ１３５、ＰＧＴ１３６、ＰＧＴ１３７逡逑等），ｇｐ４１邋上的邋ＭＰＥＲ（４Ｅ１０、２Ｆ５、Ｚ１３ｅｌ、ｍ６６、ＣＡＰ２０６－ＣＨ１２、１０Ｅ８邋等），ｇｐｌ２０逡逑８
本文编号：2729190
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R392
【图文】：
ｇｐｌ２０上有５个可变区（Ｖ１－Ｖ５）和５个恒定区（Ｃ１－Ｃ５）邋［１９－２１］，可变区和恒逡逑定区相间排列，可变区由链间Ｃｙｓ残基形成的二硫键形成环状（ｌｏｏｐ），因此也被逡逑称为Ｖ１－Ｖ５环（Ｖｌ－Ｖ５邋１ｏｏｐ）（图１）。ＶＩ区的功能意义尚不明确，有研宄指出和逡逑野生型相比，ＶＩ区羧基末端发生突变会降低病毒合胞体的形成［２２］。Ｖ１Ｖ２区是氨逡逑基酸长度和糖基化位点变化最多的区域［２３－２７］，邋Ｖ３环和Ｃ２、Ｃ３和Ｃ４区长度变化逡逑相对较小。Ｃｕｒｌｉｎ等人分析了从１５４例临床病人分离的５１８５条ＨＩＶ－１邋ｇｐｌ２０核苷酸逡逑序列，发现Ｖ１Ｖ２区的长度和糖基化位点（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ邋Ｎ－ｌｉｎｋｅｄ邋ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ邋ｓｉｔｅ，逡逑ＰＮＬＧＳ）数会随着感染时间变化，并且Ｖ１Ｖ２长度的变化可能会促进病毒逃避宿主逡逑体液免疫反应［２８］。（：１、０３和＃辞鈌校0４受体结合域［２９－３１］。￥３环长度相对恒逡逑定，一般有３４－３５个氨基酸，但是氨基酸序列高度可变［２２］，其上有中和抗体识别逡逑７逡逑
ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒ邋５，邋ＣＣＲ５）或邋ＣＸＣ邋趋化因子受体邋４邋（ＣＸＣ邋ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ邋ｒｅｃｅｐｔｏｒ邋４，逡逑ＣＸＣＲ４）结合，导致病毒与靶细胞的融合，并将病毒的核心成分释放入靶细胞的细逡逑胞质内（图２）邋［４７］。逡逑ＨＩＶ－１包膜蛋白是中和抗体识别的主要靶点，目前已获得了近百种具有广谱中逡逑和性的单克隆抗体（ｂｒｏａｄ邋ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ邋ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ邋ａｎｔｉｂｏｄｙ，邋ｂｎｍＡｂ）邋［４８］，它们可以逡逑识别邋ｇｐｌ２０邋上的邋ＣＤ４邋结合位点（ＶＲＣ０１、ＮＩＨ４５－４６、１２Ａ１２、３ＢＮＣ１１７、ＶＲＣ－ＰＧ０４、逡逑ＶＲＣ－ＣＨ３１、ＶＲＣ１３、ＶＲＣ１６、Ｍ２、ＨＪ１６、ＶＲＣ０３、１Ｂ２５３０、８ＡＮＣ１３１邋等），Ｖ１／Ｖ２逡逑可变区（ＰＧ９、ＰＧ１６、ＣＨＯＩ、ＣＨ０２、ＣＨ０３、ＣＨ０４、ＰＧＴ１４１、ＰＧＴ１４２、ＰＧＴ１４３、逡逑ＰＧＴ邋１４４、ＰＧＴ１４５、２９０９邋等），Ｖ３邋区（ＰＧＴ１２１、ＰＧＴ１２８、２Ｇ１２、ＰＧＴ１２２、ＰＧＴ１２３、逡逑ＰＧＴ１２５、ＰＧＴ１２６、ＰＧＴ１２７、ＰＧＴ１２９、ＰＧＴ１３０、ＰＧＴ１３１、ＰＧＴ１３５、ＰＧＴ１３６、ＰＧＴ１３７逡逑等），ｇｐ４１邋上的邋ＭＰＥＲ（４Ｅ１０、２Ｆ５、Ｚ１３ｅｌ、ｍ６６、ＣＡＰ２０６－ＣＨ１２、１０Ｅ８邋等），ｇｐｌ２０逡逑８
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 宋红勇;楚鹰;吴稚伟;;HIV-1膜蛋白GP120V1/V2区域的真核表达、纯化和鉴定[J];中国免疫学杂志;2012年02期
本文编号：2729190
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/jichuyixue/2729190.html
