产肠毒素大肠杆菌溶血素HlyA的原核表达、多抗制备及相关功能探析

发布时间：2017-03-29 00:15

  本文关键词：产肠毒素大肠杆菌溶血素HlyA的原核表达、多抗制备及相关功能探析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)是一种重要的食源性致病菌,可引起人或幼畜(初生羔羊、犊牛及断奶仔猪)的腹泻,是断奶仔猪腹泻的主要病原菌,其高发病率和高死亡率的特点给养殖业造成严重的经济损失。K88ac+ETEC血清型为国内初生及断奶仔猪腹泻的优势血清型,其主要毒力因子包括黏附素菌毛、肠毒素、内毒素、水肿病毒素、溶血素等。ETEC的黏附素菌毛、不耐热肠毒素(Heat-labile enterotoxin,LT)、耐热性肠毒素(Heat-stable enterotoxin, ST)等毒力因子受到广泛关注,但作为尿路致病性大肠杆菌(Uropathogenic Escherichia coli,UPEC)、肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhage Escherichia coli, EHEC)重要毒力因子的溶血素在ETEC致病机理中的功能却鲜有报道,故本研究选择K88ac+ETEC作为试验对象,初步探究溶血素在ETEC致病中的作用。通过PCR方法扩增负责表达大肠杆菌C83902溶血素亚单位HlyC、HlyA的基因hlyC, hlyA,将其克隆至原核表达载体pET-28a(+),构建重组表达载体pET-28a(+)-hlyCA,经酶切验证、测序,确定质粒的成功构建。将重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞后,经IPTG诱导和Ni-NTA亲和层析获得高纯度的融合蛋白HlyA。纯化后的重组蛋白用两种方法免疫新西兰白兔,获得特异性较高的兔源抗HlyA多克隆抗体血清。本研究构建、表达并获得高纯度的融合蛋白HlyA,经免疫后成功获得兔源HlyA抗体,为进一步探究大肠杆菌溶血素HlyA的生物学功能及致病机理奠定基础。利用ETEC标准株C83902、已构建的溶血素hlyA基因缺失株C83902A hlyA和回补株C83902A hlyA/phlyA,通过荧光定量PCR从转录水平研究溶血素与ETEC其他重要毒力因子的关系,初步探索了溶血素在细菌胞外的存在形式,并对仔猪空肠上皮细胞IPEC-J2细胞系进行了粘附和粘附抑制试验、细胞形态学观察、细胞毒性试验等一系列功能性探索。Real-time PCR试验结果表明溶血素的缺失使得sepA(编码丝氨酸蛋白酶主要结构亚基)的转录水平上调了83%(p0.01),fimH(编码Ⅰ型菌毛主要结构亚基)和eltB(编码热不稳定肠毒素主要结构亚基)分别下调约40%和21%(p0.01),faeG(编码K88菌毛主要结构亚基)显著下调了约24%(p0.05),而对fliC(编码鞭毛丝蛋白主要结构亚基)的转录无显著影响。上述结果表明溶血素与丝氨酸蛋白酶可能存在相互调控机制,且溶血素的表达可能与细菌对宿主细胞的黏附有关。对外膜囊泡(outer membrane vesicle, OMV)及溶血素进行分离鉴定后,发现溶血素除游离形式存在外,还能以与外膜囊泡结合的形式存在于细菌上清中,验证了外膜囊泡可以作为溶血素运输载体的假说。IPEC-J2的细胞黏附与黏附抑制试验结果表明溶血素缺失株组的细菌粘附数量为野生株组的2.13倍(p0.01),细胞形态学观察发现细胞经溶血素作用后形态变圆变小,且细胞毒性试验结果表明溶血素可引起细胞死亡,综合IPEC-J2细胞的各项试验可以说明溶血素对仔猪空肠上皮细胞具有细胞毒性,且可能降解细胞间连接蛋白,因而引起上皮细胞脱落从而使得细菌可以从肠道排出,这种排菌机制理论与溶血素缺失株细菌黏附数量提高的试验结果相一致。
【关键词】：K88ac~+ETEC 溶血素HlyA 原核表达 多克隆抗体 OMV 黏附 细胞毒性
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.61;R378
【目录】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-11
• 符号说明11-12
• 文献综述12-25
• 1. 溶血素的表达与调控12-13
• 1.1 溶血素操纵子12
• 1.2 基因的调控12-13
• 2. HlyA的加工与分泌13-14
• 2.1 HlyC的酰化作用13
• 2.2 Ⅰ型分泌系统13-14
• 3. HlyA的运输形式14-16
• 4. Hly与其他毒力因子的相互作用16-17
• 5. HlyA与宿主细胞的相互作用17-20
• 5.1 细胞脱落作用17-18
• 5.2 宿主的炎性反应18
• 5.3 促凋亡作用18-19
• 5.4 促吞噬作用19
• 5.5 促氧化作用19-20
• 参考文献20-25
• 研究一 ETEC大肠杆菌溶血素HlyA的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备25-40
• 1. 材料26-27
• 1.1 菌株、质粒26
• 1.2 培养基和主要试剂26
• 1.3 实验动物26
• 1.4 主要仪器26-27
• 2. 方法27-33
• 2.1 引物设计及合成27
• 2.2 PCR扩增目的基因27-28
• 2.2.1 PCR模板的制备27
• 2.2.2 PCR反应体系与程序27-28
• 2.3 PCR产物纯化与回收28
• 2.4 氯化钙法制备DH5口感受态细胞28
• 2.5 连接与转化28-29
• 2.5.1 克隆片段与T载体连接28-29
• 2.5.2 连接片段导入感受态细胞29
• 2.6 阳性克隆的筛选与鉴定29-30
• 2.6.1 碱裂解法小提质粒29
• 2.6.2 鉴定及测序29-30
• 2.7 重组原核表达质粒的构建与鉴定30-31
• 2.7.1 酶切与连接30
• 2.7.2 电转化感受态细胞的制备30
• 2.7.3 电转化30
• 2.7.4 鉴定及测序30-31
• 2.8 HlyA在pET-28a(+)载体中的原核表达31-32
• 2.8.1 HlyA重组蛋白的表达条件分析31
• 2.8.2 HlyA重组蛋白的表达及表达形式分析31-32
• 2.9 HlyA重组蛋白的变性、纯化、复性与浓缩32
• 2.10 HlyA重组蛋白Western-blot鉴定32
• 2.11 HlyA重组蛋白兔源多抗血清的制备与鉴定32-33
• 2.11.1 动物免疫32-33
• 2.11.1.1 弗氏佐剂免疫32
• 2.11.1.2 QuickAntibody快速佐剂免疫32-33
• 2.11.2 ELISA测定血清效价33
• 2.11.3 HlyA重组蛋白兔源多抗的Western-blot检测33
• 2.11.4 HlyA重组蛋白兔源多抗血清的采集分离33
• 3. 结果33-38
• 3.1 hlyCA的PCR产物鉴定33-34
• 3.2 重组表达质粒pET-28a-hlyCA鉴定及其单双酶切鉴定34-35
• 3.3 HlyA重组蛋白的诱导条件和表达形式分析35-37
• 3.4 HlyA重组蛋白的纯化与Western blot鉴定37-38
• 3.5 重组蛋白HlyA兔源多克隆抗体的制备及鉴定38
• 4. 讨论38-40
• 研究二 ETEC溶血素HlyA的生物学功能研究40-58
• 1. 材料41-42
• 1.1 菌株、细胞41-42
• 1.2 培养基和主要试剂42
• 1.3 主要仪器42
• 2. 方法42-47
• 2.1 qRT-PCR检测野生株、突变株和回补株中相关基因表达量变化42-45
• 2.1.1 设计引物42-43
• 2.1.2 Trizol法RNA抽提43
• 2.1.3 cDNA的合成43-44
• 2.1.4 PCR鉴定cDNA44
• 2.1.5 qRT-PCR反应44-45
• 2.2 溶血素表达形式的鉴定45
• 2.2.1 外膜囊泡及溶血素的分离45
• 2.2.2 外膜囊泡及溶血素的Western blot鉴定45
• 2.3 IPEC-J2细胞的体外粘附试验45-46
• 2.3.1 IPEC-J2细胞的培养与传代46
• 2.3.2 IPEC-J2细胞的黏附试验46
• 2.3.3 IPEC-J2细胞的黏附抑制试验46
• 2.3.4 IPEC-J2细胞的血清黏附抑制试验46
• 2.4 IPEC-J2细胞形态学变化观察46-47
• 2.5 IPEC-J2细胞毒性试验47
• 3. 结果47-55
• 3.1 荧光定量PCR检测hlyA基因缺失对其它毒力因子的影响47-48
• 3.2 溶血素表达形式的鉴定48-49
• 3.3 IPEC-J2细胞的黏附试验和黏附抑制试验49-52
• 3.3.1 IPEC-J2细胞的黏附试验49-50
• 3.3.2 IPEC-J2细胞的黏附抑制试验50-51
• 3.3.3 IPEC-J2细胞的血清黏附抑制试验51-52
• 3.4 HlyA对IPEC-J2细胞形态的影响52-54
• 3.5 HlyA对IPEC-J2细胞的细胞毒性试验54-55
• 4. 讨论55-58
• 4.1 荧光定量PCR检测hlyA基因缺失对其它毒力因子的影响55
• 4.2 溶血素表达形式的鉴定55-56
• 4.3 IPEC-J2细胞黏附试验和黏附抑制试验56-58
• 参考文献58-59
• 全文总结59-60
• 致谢60-61

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3 张衍海;白艳艳;张彦明;郑增忍;张宝;童光志;;产单核细胞李斯特菌溶血素基因的克隆及原核表达[J];中国预防兽医学报;2008年11期

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本文编号：273330