【摘要】：目的:原发性肝癌是我国第四位常见的恶性肿瘤及第三位的肿瘤致死病因,严重威胁我国人民的生命与健康,由于原发性肝癌患者的术后复发率及转移率居高不下,因此揭示疾病的发展机制对于改善原发性肝癌的预后有着重要意义。DEK蛋白是一种结构蛋白参与各种基本的核进程,并且在多种恶性肿瘤中均呈现出高表达趋势,DEK基因在原发性肝癌中是否也起到了至关重要的作用目前尚无明确的研究证实。本课题拟对DEK基因在原发性肝癌中所起的作用进行临床及动物实验研究,以进一步揭示DEK基因与原发性肝癌之间的关系及DEK基因的基本功能。方法:11、收集重庆医科大学附属第二医院肝胆外科行手术治疗的原发性肝癌患者的临床样本50例,采用HE染色验证癌组织及癌旁组织可以用来进行后续实验。采用Western Blot和Real-Time PCR分别检测DEK的蛋白质及mRNA表达水平,采用免疫荧光检测DEK蛋白的定位情况,并与临床病理因素进行相关性分析。2、建立肝脏特异性DEK基因敲除小鼠模型,实验分DEK~(fl/fl)组、DEK~(fl/fl)/Alb-Cre组,采用HE染色检测小鼠肝脏组织病理形态;采用Western Blot、Real-Time PCR和免疫荧光分别在蛋白和mRNA水平检测DEK是否被敲除。分别选择出生后1周、3周、5周、7周及9周的DEK~(fl/fl)小鼠及DEK~(fl/fl)/Alb-Cre小鼠各三只称量其体重及肝脏质量初步分析其表型。选择5周左右的小鼠行肝叶切除术以诱导肝脏增殖,分别在术前、术后4天、7天、14天、21天及28天处死小鼠,采用EDU细胞增殖实验和TUNEL原位末端凋亡法检测小鼠肝脏的增殖和凋亡情况。3、选择DEK~(fl/fl)小鼠及DEK~(fl/fl)/Alb-Cre小鼠各3只取出肝脏组织进行匀浆,将匀浆液送至深圳海一公司进行RNA-seq测序分析。结果:1、原发性肝癌患者HE染色结果证实肿瘤组织中有癌细胞浸润,癌旁组织中无肿瘤细胞浸润。2、原发性肝癌患者Real-Time PCR结果显示,肿瘤组织中DEK mRNA表达量显著高于相邻的癌旁组织(p0.05)。3、原发性肝癌患者Western Blot结果显示,肿瘤组织中DEK蛋白表达量显著高于相邻的癌旁组织。4、原发性肝癌患者免疫荧光结果显示,DEK蛋白主要定位于细胞核中,且肿瘤组织中的DEK蛋白表达量高于相邻的癌旁组织。5、DEK的表达与原发性肝癌患者临床病理相关因素分析结果显示:DEK的表达与是否发生肝硬化有关(p0.0079),同时也与肿瘤的G1/G2、G3分期有关(p0.0001)。6、建立肝脏特异性DEK基因敲除小鼠模型(1)Genotyping结果显示DEK~(fl/fl)小鼠及DEK~(fl/fl)/Alb-Cre小鼠均含有387 bp的DEK基因条带,而仅有DEK~(fl/fl)/Alb-Cre小鼠含有272bp的Cre基因条带。(2)敲除效率检测结果显示仅有DEK~(fl/fl)/Alb-Cre小鼠肝脏组织中有520bp的Deletion阳性条带而DEK~(fl/fl)小鼠无Deletion阳性条带。(3)Western Blot结果显示DEK~(fl/fl)/Alb-Cre小鼠的肝脏组织中DEK蛋白表达量显著低于DEK~(fl/fl)小鼠,而小鼠的肺及肾脏中DEK蛋白表达量无差异。(4)Real-Time PCR结果显示DEK~(fl/fl)/Alb-Cre小鼠的肝脏组织中DEK mRNA表达量显著低于DEK~(fl/fl)小鼠(p0.05)。(5)免疫荧光结果显示DEK~(fl/fl)小鼠所有肝细胞的细胞核中均出现DEK红色荧光而DEK~(fl/fl)/Alb-Cre小鼠中无DEK荧光信号。7、小鼠出生后分别在不同时间点处死小鼠称量小鼠体重及肝脏质量结果显示,DEK~(fl/fl)/Alb-Cre小鼠与DEK~(fl/fl)小鼠相比体重及肝脏质量均无显著变化(P0.05)。8、肝叶切除术后不同时间点检测肝脏增殖情况结果显示,DEK~(fl/fl)/Alb-Cre小鼠肝脏组织的增殖显著低于DEK~(fl/fl)小鼠(p0.05),这个差异在肝叶切除术后七天达顶峰。9、肝叶切除术后不同时间点检测肝脏凋亡情况结果显示,DEK~(fl/fl)/Alb-Cre小鼠肝脏组织的凋亡与DEK~(fl/fl)小鼠相比并无显著差异(p0.05)。10、RNA-seq测序分析的结果(1)差异表达基因分析结果显示,DEK~(fl/fl)/Alb-Cre小鼠与DEK~(fl/fl)小鼠相比共有58个差异表达基因(差异≥2倍;p0.05),其中有46个上调12个下调,Col7a1是上调最为显著的,而Nlrp6是下调最为显著的。(2)GO分析表明共得到396个GO Term,其中有223个为生物过程(56.31%,biological process,BP),富集最为显著的是氧化还原过程(GO:0055114)和环氧化酶P450途径(GO:0019373);有84个为细胞组分(21.22%,cellular component,CC),富集最为显著的是细胞投射(GO:0042995)和胶原蛋白三聚体(GO:0005581);共有89个为分子功能(22.47%,Molecular Function,MF),富集最为显著的是氧化还原酶活性(GO:0016491)和单加氧酶活性(GO:0004497)。(3)KEGG途径分析表明,差异基因组显著富集的通路主要是代谢途径,类固醇激素生物合成途径,视黄醇代谢途径等,其中最富集的通路是代谢途径,共有7个上调的差异基因富集到该通路。结论:1、本实验证实原发性肝癌患者肿瘤组织中DEK的蛋白表达量及mRNA表达量均高于相邻的癌旁组织,且DEK蛋白仅在细胞核中表达。2、在原发性肝癌中DEK的表达与是否发生肝硬化及肿瘤的G1/G2、G3分期有关,而与性别、年龄和分化程度等无关。3、本实验成功构建肝脏特异性DEK基因敲除小鼠模型,并证实DEK基因主要影响肝脏的增殖。4、差异表达基因聚类分析发现共有共有58个差异表达基因,其中46个上调12个下调,Col7a1是上调最为显著的,而Nlrp6是下调最为显著的。5、GO分析表明在生物过程中差异基因最富集GO Term是氧化还原过程,细胞组分中最富及的GO Term是细胞投射,分子功能中最富集的GO Term是氧化还原酶活性。KEGG途径分析表明差异表达基因主要参与的途径是代谢途径,类固醇激素生物合成途径,视黄醇代谢途径。其中最富集的通路是代谢途径,共有7个上调的差异基因富集到该通路。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R735.7;R-332
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