高通量测序法研究组蛋白H2A变体及H3K79me3修饰在小鼠精子发生过程的表观遗传变化
发布时间：2020-07-06 23:51
【摘要】：精子是雄性生殖细胞终末分化细胞,其染色体为实现精子功能,亦产生了特异的变化。与体细胞不同,精子染色体主要由DNA缠绕精蛋白组成,精子细胞核内DNA高度压缩,在哺乳动物的精子中,仅残留约5%-15%的组蛋白。在精子发生的过程中,精原细胞经过自身有丝分裂、初级精母细胞和次级精母细胞的减数分裂及精子形成过程实现精子的成熟。伴随该过程,精子染色体亦发生剧烈的特征性变化,在减数分裂阶段,染色质经历联会及两次减数分裂的过程,在精子形成过程,染色质经历组蛋白过渡蛋白替换、过渡蛋白精蛋白替换的过程,以上过程伴随着剧烈的表观遗传方面的变化。本研究采用高通量测序的方法,尝试阐释在小鼠精子发生过程中组蛋白H2A变体在粗线期初级精母细胞及圆形精子细胞内的动态变化状态及其生物学功能,以及组蛋白修饰H3K79me3在粗线期出现的作用。研究采用STA-PUT的方法,在小鼠睾丸中分离粗线期初级精母细胞及圆形精子;采用Native-ChIP的方法,对分离细胞进行建库。经高通量测序的数据,结合公共数据库报道的数据,采用生物信息学的方法,在基因定位、染色体定位及与转录水平关系的方面对组蛋白H2A变体在分离细胞中的分布进行研究;结合公共数据,对粗线期初级精母细胞中组蛋白修饰H3K79me3占位序列与其他修饰、变体间的占位相互关系及其与转录的关系和该修饰占位基因的功能等方面进行分析。研究成功构建了组蛋白H2A变体H2A.Z、γH2A.X、macroH2A在粗线期及圆形精子阶段及H3K79me3在粗线期的Native-ChIP测序文库。首次以ChIP-seq的方法,即单核小体分辨率水平,描述了研究中涉及的各变体在粗线期和圆形精子细胞中分布和定位的情况及H3K79me3在粗线期染色体上的分布状况。研究发现,组蛋白H2A变体在所分离的细胞阶段在基因上的定位极为有限,且大部分分布于基因间隔区和内含子区,组蛋白H2A变体对圆形精子阶段性染色体转录再激活无直接作用,发现研究中涉及的组蛋白H2A各变体在分离细胞阶段的功能与转录调控无直接关系,可能参与染色质结构的组织和染色质重塑。此外发现,圆形精子阶段组蛋白变体间存在较强的共定位现象,提示在该阶段组蛋白H2A变体间存在较强的替换。另外,在精子发生体系中,采用生物信息分析的方法验证了 H3K4me3与H3K79me3之间存在相互作用的结论,结合转录组数据,发现H3K79me3在粗线期的出现与转录激活相关,特别是与粗线期至圆形精子阶段的特异基因的转录激活相关,该发现不同于已有基于免疫荧光染色观察的发现。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R321.1
【图文】：
以在基因组范围以染色质角度来理解细胞特征。目前，己知的表观遗传分子机制包逡逑括ＤＮＡ甲基化、组蛋白修饰及组蛋白变体、染色质重塑和ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇＲＮＡ等几个逡逑方面（图１）。逡逑ＤＮＡ甲基化通常是指５ｍＣ，即胞嘧啶的第５位碳原子被加上了一个甲基，５ｍＣ逡逑在基因表达调控、转座子的沉默和异染色质的维持方面有重要作用，其功能主要是逡逑抑制基因的表达，特别是在启动区和转录起始位点的甲基化，因此５ｍＣ也被称为逡逑“第五种碱基”。逡逑组蛋白的修饰可以影响核小体间的相互作用，从而进一步影响整个染色质的结逡逑构。目前认为组蛋白的翻译后修饰主要是用来调节染色质结构和功能，其具体机制逡逑包括以下两种［２，３］：邋—是，组蛋白的翻译后修饰通过改变组蛋白的电荷状态或改变临逡逑近核小体相互作用状态的方式直接调节染色质的折叠，进而调节染色质高级结构和逡逑ＤＮＡ结合蛋白可接近性。此外
是一个动态的生物学过程，过程中会产生新的核小体结构，进而改变染色质的组成逡逑及状态。在动物体内，Ｈ３，邋Ｈ２Ａ，Ｈ２Ｂ及ＨＩ组蛋白变体均有发现，而Ｈ４是目前逡逑哺乳动物中唯一没有变体的组蛋白。以小鼠为例，绘制的组蛋白进化树见图２。目逡逑前，研宄较多的Ｈ２Ａ组蛋白变体有Ｈ２Ａ．Ｘ、Ｈ２Ａ．Ｚ、ｍａｃｒｏＨ２Ａ和Ｈ２Ａ．Ｂ，Ｈ３组逡逑蛋白变体有Ｈ３．３、着丝粒特异变体ＣＥＮＰ－Ａ、睾丸中特异表达的Ｈ３ｔ和Ｈ３．５及仅逡逑在灵长类细胞中存在的Ｈ３．Ｘ和Ｈ３．Ｙｍ。逡逑７逡逑
由于其特殊的功能，精子有其特殊的细胞学特性和遗传学特性。精子染色质在逡逑组成上和结构上，与体细胞相比均有极大的差异。目前，根据已有的知识，对哺乳逡逑动物精子染色质提出的模型如图３示：大部分精子ＤＮＡ被精蛋白缠绕，形成紧密逡逑的圆环状，这是哺＾＾动物细胞精子染色质结构最大特征［８＿１（）］，该比例的ＤＮＡ在人类逡逑精子中约占８５－９５％［１１Ｍ３］。缠绕于每个精蛋白圆环（ｐｒｏｔａｍｉｎｅｔｏｒｏｉｄ）的ＤＮＡ总长逡逑度约５０ｋｂ，另有证据表明，每个精蛋白圆环皆为一个ＤＮＡｌｏｏｐ结构域（ＤＮＡｌｏｏｐ逡逑ｄｏｍａｉｎ）邋［１４］。精蛋白圆环之间由短的ＤＮＡ相连，被称为精蛋白ｌｉｎｋｅｒ邋（ｐｒｏｔａｍｉｎｅ逡逑ｌｉｎｋｅｒ）。这些ｌｉｎｋｅｒ对ＤＮＡ损伤剂极为敏感。精蛋白圆环之间的排列呈堆积的救生逡逑圈状［１５］，而染色质更高级的排布结构仍然未知。剩余的基因组ＤＮＡ则是仍然结合逡逑在组蛋白上，以核小体的形式保留于精子染色体上［１１，１３］。精子中核小体并非随机分逡逑布于整个基因组［１６，１７］，某些发育早期的基因会以核小体的形式存在于染色体上。根逡逑据目前研究结果，人类精子中组蛋白结合的染色质区域可以分为两类：一类是ｌ0ｋｂ逡逑或者更大的结构域
本文编号：2744317
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R321.1
【图文】：
以在基因组范围以染色质角度来理解细胞特征。目前，己知的表观遗传分子机制包逡逑括ＤＮＡ甲基化、组蛋白修饰及组蛋白变体、染色质重塑和ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇＲＮＡ等几个逡逑方面（图１）。逡逑ＤＮＡ甲基化通常是指５ｍＣ，即胞嘧啶的第５位碳原子被加上了一个甲基，５ｍＣ逡逑在基因表达调控、转座子的沉默和异染色质的维持方面有重要作用，其功能主要是逡逑抑制基因的表达，特别是在启动区和转录起始位点的甲基化，因此５ｍＣ也被称为逡逑“第五种碱基”。逡逑组蛋白的修饰可以影响核小体间的相互作用，从而进一步影响整个染色质的结逡逑构。目前认为组蛋白的翻译后修饰主要是用来调节染色质结构和功能，其具体机制逡逑包括以下两种［２，３］：邋—是，组蛋白的翻译后修饰通过改变组蛋白的电荷状态或改变临逡逑近核小体相互作用状态的方式直接调节染色质的折叠，进而调节染色质高级结构和逡逑ＤＮＡ结合蛋白可接近性。此外
是一个动态的生物学过程，过程中会产生新的核小体结构，进而改变染色质的组成逡逑及状态。在动物体内，Ｈ３，邋Ｈ２Ａ，Ｈ２Ｂ及ＨＩ组蛋白变体均有发现，而Ｈ４是目前逡逑哺乳动物中唯一没有变体的组蛋白。以小鼠为例，绘制的组蛋白进化树见图２。目逡逑前，研宄较多的Ｈ２Ａ组蛋白变体有Ｈ２Ａ．Ｘ、Ｈ２Ａ．Ｚ、ｍａｃｒｏＨ２Ａ和Ｈ２Ａ．Ｂ，Ｈ３组逡逑蛋白变体有Ｈ３．３、着丝粒特异变体ＣＥＮＰ－Ａ、睾丸中特异表达的Ｈ３ｔ和Ｈ３．５及仅逡逑在灵长类细胞中存在的Ｈ３．Ｘ和Ｈ３．Ｙｍ。逡逑７逡逑
由于其特殊的功能，精子有其特殊的细胞学特性和遗传学特性。精子染色质在逡逑组成上和结构上，与体细胞相比均有极大的差异。目前，根据已有的知识，对哺乳逡逑动物精子染色质提出的模型如图３示：大部分精子ＤＮＡ被精蛋白缠绕，形成紧密逡逑的圆环状，这是哺＾＾动物细胞精子染色质结构最大特征［８＿１（）］，该比例的ＤＮＡ在人类逡逑精子中约占８５－９５％［１１Ｍ３］。缠绕于每个精蛋白圆环（ｐｒｏｔａｍｉｎｅｔｏｒｏｉｄ）的ＤＮＡ总长逡逑度约５０ｋｂ，另有证据表明，每个精蛋白圆环皆为一个ＤＮＡｌｏｏｐ结构域（ＤＮＡｌｏｏｐ逡逑ｄｏｍａｉｎ）邋［１４］。精蛋白圆环之间由短的ＤＮＡ相连，被称为精蛋白ｌｉｎｋｅｒ邋（ｐｒｏｔａｍｉｎｅ逡逑ｌｉｎｋｅｒ）。这些ｌｉｎｋｅｒ对ＤＮＡ损伤剂极为敏感。精蛋白圆环之间的排列呈堆积的救生逡逑圈状［１５］，而染色质更高级的排布结构仍然未知。剩余的基因组ＤＮＡ则是仍然结合逡逑在组蛋白上，以核小体的形式保留于精子染色体上［１１，１３］。精子中核小体并非随机分逡逑布于整个基因组［１６，１７］，某些发育早期的基因会以核小体的形式存在于染色体上。根逡逑据目前研究结果，人类精子中组蛋白结合的染色质区域可以分为两类：一类是ｌ0ｋｂ逡逑或者更大的结构域
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