NTRK1修饰的人外周血间充质干细胞移植入帕金森病模型大鼠模型的效应

发布时间：2020-07-10 20:38

【摘要】：研究背景:自从1995年后,间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)在临床试验中被广泛使用。它们具有细胞的三种性能:(1)具有粘附能力,在进行细胞培养时,MSCs可贴壁生长;(2)MSCs表达CD29、CD73、CD90 以及 CD105 等标志物,不表达 CD34、CD45、CD14、CD19和人白细胞抗原Ⅱ类(Human leukocyte antigen,HLA)等标志物;(3)具有多向分化的潜能,可向多个细胞系分化,如:神经元细胞、骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞、胰岛样细胞和纤维母细胞,能够替代原有损伤的细胞和组织。已有文献报道,MSCs在人体内,无论是动物体内,还是大鼠体内,能够分化为多巴胺(Dopamine,DA)神经元。大量的研究已经显示,MSCs在细胞治疗的领域具有巨大的潜在效应,可作为一种新的治疗手段,在一定程度上能治疗许多目前无法治愈的疾病,包括心脏病、神经元退行性疾病、血液系统恶性肿瘤、自身免疫性疾病等。此外,MSCs还广泛用于治疗各种疾病动物模型的研究中,如:麻醉所致的脊髓损伤、风湿性疾病、创伤修复的治疗和骨骼肌的重建等。帕金森病是全球第二大神经退行性疾病,主要病理生理机制为中脑黑质(substantia nigra,SN)多巴胺神经元进行性变性死亡,促发一系列炎症反应,并引起恶性循环,导致DA生成障碍,残存的神经元胞内出现Lewy小体。PD起病隐袭,其核心症状为运动症状,以静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势步态障碍等主要表现,同时伴随非运动症状,主要包括感觉异常、精神症状、睡眠障碍、自主神经功能障碍。目前仍缺乏有效的治愈手段,因此寻求行而有效的PD治疗手段极为重要。迄今普遍认为,6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)损毁帕金森大鼠模型和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)诱导帕金森小鼠模型是比较完善的PD动物模型。6-OHDA损毁PD大鼠模型行为变化稳定可靠且持续时间长,可采用运动反应时间、步态调整和爪回缩、楼梯和固定棒挤压等实验对大鼠的运动起始不能、控制僵直等方面进行定量测试,更适合用于PD的细胞移植、基因治疗、临床前药物研究、药理疗效判定和神经保护等方面的研究。我们尝试把PBMSCs注射入PD大鼠模型脑内,并评估PBMSCs对多巴胺神经元产生的效应。然而,仅有MSCs的效应是不明显的。对于促进MSCs疗法的功效,医学科学研究具有重要意义。MSCs治疗是PD细胞治疗的热点之一,基因修饰MSCs更是PD治疗的新兴方向,以MCSs作为有效的基因载体,用特定的单个或多个基因修饰,移植入脑内以达到治疗PD的疗效。国内外己有学者把基因治疗与干细胞移植的治疗方法用于PD模型动物中,并取得一定的可喜的成效。目前尚无NTRK1修饰的PBMSCs对PD模型大鼠的效应。神经营养酪氨酸受体激酶1(Neurotrophic tyrosine receptor kinase 1,NTRK1)是神经生长因子(nerve growth factor,NGF)高亲和力的受体,NGF主要通过NTRK1发挥生物学效应。NGF是一种信号蛋白,是重要的神经营养因子,具有营养神经元和促突起生长的生物学功能,它对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达均具有重要的调控作用。上述生物学效应的产生需要其与特异性受体NTRK1结合。据报道称,在NGF刺激下,NTRK1表达升高会增加神经干细胞向胆碱能神经元的分化。对于PD,NTRK1由移植的MSCs细胞释放到附近的神经干细胞,能够促进神经干细胞分化为特定的神经类型细胞,例如帕金森病模型大鼠的黑质多巴胺神经元。在本试验,我们首次选取PB-MSCs,非其他来源的MSCs,作为治疗的干细胞,移植入6-OHDA损毁PD大鼠模型,旨在探讨PB-MSCs对PD模型大鼠病灶是否有修复作用和免疫调节以及NTRK1基因修饰的PB-MSCs能否促进上述效应。研究目的:MSCs治疗是PD细胞治疗的热点之一,基因修饰MSCs更是PD治疗的新兴方向,本实验探讨PB-MSCs对PD模型大鼠病灶是否有修复和免疫调节作用以及NTRK1基因修饰的PB-MSCs能否促进上述效应。(1)探讨PB-MSCs能否可以作为PD模型大鼠的种植细胞;(2)探讨PB-MSCs移植至PD模型大鼠后,PD模型大鼠的行为学改变,以及移植后PD模型大鼠的行为学改善的最佳时期;(3)探讨PB-MSCs移植至PD模型大鼠后,在行为学改善最佳的时期,PD模型大鼠脑内的DA存活量;(4)探讨PB-MSCs移植至PD模型大鼠后,在行为学改善最佳的时期,PD模型大鼠脑内的促炎因子表达水平;(5)探讨NTRK1基因修饰的PB-MSCs移植至PD模型大鼠后,在行为学改善最佳的时期,PD模型大鼠脑内的DA存活量;(6)探讨NTRK1基因修饰的PB-MSCs移植至PD模型大鼠后,在行为学改善最佳的时期,PD模型大鼠脑内的促炎因子表达水平。实验动物及方法:我们用体重相近的若干只雄性Sprague Dawley(SD)大鼠作为实验动物,借助脑立体定向仪将适量6-OHDA注射入SD大鼠中的黑质和前脑内侧束来建立PD大鼠模型,1个月后,借助阿扑吗啡诱导SD大鼠旋转,符合行为行为学改变的被评为PD模型成功建立。分离、纯化和富集5个健康志愿者的外周血以获取PB-MSCs,经过原代培养和5次传代培养以获得更高数量的PB-MSCs,选用生长状态良好的 PB-MSC,用单克隆抗体 CD34-FITC,CD45-PE,CD29-APC,和CD105-PE-Cy7对PB-MSCs的表型进行化学鉴定。构建穿梭质粒pUC118-NTRK1,转化并使扩增,鉴定后,构建和鉴定pAdenoX-CMV-NTRK11重组腺病毒。以 PB-MSCs作为载体,用pAdenoX-CMV-NTRK1重组腺病毒感染PB-MSCs,使其过表达NTRK1。通过定向脑内注射将 PBS、NTRK1、PB-MSCs、NTRK1-PB-MSCs注入PD大鼠的黑质和纹状体;通过旋转试验在细胞移植后2周、4周、6周、8周对各组PD大鼠的旋转圈数进行评定,以获知细胞移植后PD大鼠行为改变的最佳时期;PD大鼠移植PB-MSCs 8周后,灌流固定SD大鼠,获取脑组织并冰冻切片,通过组织免疫荧光技术和组织免疫组化技术评估TH的含量以明确各组间PD模型的多巴胺神经元的含量;PD大鼠移植PB-MSCs 2周后,灌流固定SD大鼠,获取脑组织并通过Elisa测定各组PD模型的促炎因子(TNF-a和IL-1β)的表达水平。所有结果均以均数±标准差表示。应用SPSS 21.0统计软件进行数据分析,采用单因素方差分析(ANOVA)进行各组间的差异显著性检验,以P0.05为差异有显著意义。研究结果:1、人PB-MSCs的表型鉴定从5名健康供体中分离外周血MSCs,然后在适当的条件下进行培养,以保持MSCs的生物学特征。CD34,CD45,CD29和CD105是MSCs的标志物。在铺板后72小时,贴壁细胞显示出MSCs细胞特有的梭形或多边形,然后对其进行染色和流式分选。根据MSCs的表型(如图1所示:CD34-CD45-CD29+CD105+),我们将贴壁细胞鉴定为MSCs细胞而非造血干细胞。上述数据提示我们成功从外周血中分选出MSCs。2、NTRK1在PBMSCs中过表达的情况我们分别把Ad.NTRK1、Ad.null转染入PBMSCs,用RT-PCR和蛋白质免疫印迹试验分别检测各组的NTRK1和NTRK1蛋白表达的情况,结果如图2所示。图2a显示,Ad.NTRK1组的NRTK1 mRNA明显高于对照组和Ad.null组的。图2b显示Ad.NTRK1组的NTRK1蛋白的表达量是最高的,蛋白定量分析进一步显示,Ad.NTRKl组的NTRK1蛋白含量是对照组和Ad.null组的4倍(如图2c)。这些结果证实,NTRK1成功转染到PBMSCs中,并导致NTRK1蛋白水平升高。3、PD大鼠移植PBMSCs后的行为改变帕金森病模型大鼠体内被注射入过表达NTRK1的PBMSCs,然后评估旋转行为学的变化。依据既往文献,用6-OHDA建立帕金森病大鼠模型。借助立体定向仪把过表达NTRK1的MSCs移植入SN中。在移植后的2,4,6,8周评估PD模型大鼠的旋转能力。在四组(PBS组、Ad.NTRK1组、PBMSCs组和Ad.NTRK1-PBMSC组),我们发现过表达NTRK1的Ad.NTRK1-PBMSCs组的PD模型大鼠的旋转圈数减少最多,提示旋转能力的改善程度最大,其次是PBMSCs组的(如图3所示)。与PBS组相比,4周后Ad.NTRK1-PBMSCs组的PD模型大鼠的旋转圈数的减少是有显著性统计学差异的。然而,与PBS组相比,8周后PBMSCs组的PD模型大鼠的转数减少才具有显著性统计学差异。PBS组的转数与Ad.NTRK1组的相比,二者无明显统计学差异。值得注意的是,4周后,与PBMSCs组的相比,Ad.NTRK1-PBMSCs组的PD模型大鼠旋转能力的改善更为明显。这些结果显示,PBMSCs可改善PD模型大鼠的行为,而过表达的NTRK1可促进这一效应。4、PD大鼠移植PBMSCs后多巴胺神经元的变化帕金森病的主要特征是DA神经元的变性。在帕金森病大鼠模型中,注射6-OHDA后导致SN严重的DA神经元变性(如图4a所示)。在移植8周后,对SN和纹状体进行染色,来评估移植的PBMSCs对DA神经元产生的影响。SN中TH阳性细胞的定量显示,PBMSCs组有更多的TH阳性细胞,几乎是PBS组中的3倍(如图4b所示)。在PBS组与Ad.NTRK1组之间,TH 阳性细胞数量无明显差异。然而,与PB-MSC组相比,Ad.NTRK1-PBMSCs组有更多的TH阳性细胞。纹状体中的TH免疫反应性纤维也显示出相同的趋势(如图4c,d所示)。这些结果提示立体脑内定向注射PBMSCs能引起SN中TH 阳性细胞明显增多,然而此种效应在Ad.NTRK1-PBMSCs组中最为明显,意味着过表达NTRK1能够促进帕金森病模型大鼠中黑质的DA神经元的再生。5、PD模型大鼠移植PBMSCs后炎症因子的变化据报道指出,MSCs具有体内免疫调节作用的能力。为了验证PBMSCs是否具有免疫调节能力,我检测所有组别病灶中的促炎因子(TNF-a 和 IL-1β)。在 PBMSCs 组和 Ad.NTRK1-PBMSCs 组之间,上述两种细胞因子并无明显差异。然而,TN F-a和IL-1β在转染了 PBMSCs的组别中均有轻度的下降。这些结果提示,无论NTRK1是否过表达,PBMSCs对体内细胞因子的产生均有影响。研究结论:1、PBMSCs移植入PD大鼠脑内后,存活的DA增多,提示其可作为PD模型大鼠的种植细胞。2、PBMSCs移植入PD模型大鼠脑内中,病灶内存活的DA增多和PD模型大鼠的行为学改变,提示其具有修复DA的作用。3.PBMSCs移植入PD模型大鼠脑内中,病灶内促炎因子的浓度下降,提示其具有免疫调节的作用。4.NTRK1修饰的PBMSCs移植入PD模型大鼠脑内后,病灶内存活的DA进一步增多,提示NTRK1可促进PB-MSCs的旁分泌效应的作用,可进一步促进DA的修复。5.NTRK1修饰的PBMSCs移植入PD模型大鼠脑内后,病灶内促炎因子未见进一步下降,提示NTRK1修饰的PBMSCs未能进一步发挥免疫调节效益。6.PBMSCs也许可作为PD治疗的一种新型策略,NTRK1修饰PBMSCs可促进治疗PD的效应。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R742.5;R-332
【图文】：

慢病毒,过表达,内参,组间

Ｃｔｒｌ邋Ａｄ．Ｎｕｌｌ邋Ａｄ．ＮＴＲＫＩ逦Ｃｔｒｌ邋Ａｄ．Ｎｕｌｌ邋Ａｄ．ＮＴＲＫＩ逡逑图２慢病毒介导的ＮＴＲＫ１过表达的鉴定。逡逑ａ．各组间ＮＴＲＫ１邋ｍＲＮＡ的表达水平。ＧＡＰＤＨ为内参。逡逑ｂ和ｃ．各组间ＮＴＲＫ１蛋白的表达水平。ＧＡＰＤＨ为内参逡逑所有的数据均以平均数士标准差表达。逡逑

图１邋ＰＢ－ＭＳＣｓ的表型特点

行为学,大鼠,平均数,标准差

图３邋ＰＤ大鼠移植ＰＢ－ＭＳＣｓ前后的行为学改变（每组８只ＳＤ大鼠）逡逑所有的数据均以平均数土标准差表达逡逑与空白对照组相比，‘＞＜０．０１，＞＜０．０５逡逑

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