降钙素基因相关肽调控Notch信号通路与高氧致AECⅡ损伤修复的相关性研究

发布时间：2020-07-11 19:40

【摘要】：目的建立实验需要的原代早产新生大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(Alveolar epithelial typeⅡcell,AECⅡ)模型,进一步探索细胞分离纯化和培养的方法,为后续实验高体积分数氧诱导AECⅡ损伤和降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)干预高体积分数氧诱导AECⅡ损伤细胞奠定基础。探讨CGRP对高体积分数氧(即氧体积分数大于95%)暴露下的早产新生大鼠AECⅡ的影响及其意义。CGRP对高体积分数氧诱导AECⅡ损伤的保护作用是否涉及Notch信号通路,观察Notch信号通路中Notch1、Hes和HERP信号分子的改变。探明外源性神经肽类递质在高氧AECⅡ损伤时对Notch信号通路影响,为可能的治疗提供药物靶点。方法用孕19d的SPF级SD早产新生鼠的肺组织为实验细胞来源,解剖早产新生鼠快速取出其肺组织并剪碎先后用胰蛋白酶联合DNA酶和胶原酶Ⅰ消化肺组织。采用差速离心和差速贴壁的方法纯化AECⅡ,然后以Dulbecco改良的Eagle培养基/F12营养混合物(Dulbecco’s modified Eagle’s medium:Nutrientmixture F12,DMEM/F12)完全培养基培养(胎牛血清浓度为10%)。台盼蓝染色检测AECⅡ活力,巴氏染色检测AECⅡ纯度。早产大鼠原代AECⅡ分离纯化后,随机分为常氧组、高氧组、高氧+CGRP组、高氧+Gamma分泌酶抑制剂MW167组、高氧+CGRP+CGRP8-37组、高氧+Gamma分泌酶抑制剂MW167+CGRP组。常氧组在空气下培养,高氧组在氧体积分数大于95%的氧气下培养。体外培养24 h后显微镜下观察AECⅡ的细胞形态变化,CCK8检测法检测细胞存活率,流式细胞检测法检测各组AECⅠ和AECⅡ细胞凋亡情况,丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutas,SOD)分别检测氧化损伤及抗氧化损伤分析,用Western blot方法检测Notch1、Hes和HERP蛋白表达水平,QPCR检测Notch1、Hes和HERP mRNA表达情况。结果1.原代培养的AECⅡ产量较好,每只早产新生鼠可获得的肺组织中AECⅡ的数量为(8.2±1.2)×10~6,细胞的活力为(95.5±1.6)%;细胞纯度鉴定为(95.7±2.2)%。2.与常氧组比较,高氧组AECⅡ存活率及SOD含量明显下降,凋亡率及MDA含量升高(P0.05);高氧+CGRP组与高氧组比较,AECⅡ凋亡率下降,存活率增加,下调MDA,上调SOD,CGRP8-37能阻断CGRP的生物学作用。3.与常氧组比较,高氧处理组Notch1、Hes和HERP蛋白及mRNA表达显著下降(P0.05);与高氧组比较,高氧+CGRP组肺泡细胞中Notch1、Hes和HERP蛋白及mRNA表达增加(P0.05);与高氧+CGRP处理组比较,高氧+CGRP及其拮抗剂组Notch1、Hes和HERP蛋白及mRNA表达反而下降接近高氧组水平(P0.05);与高氧+CGRP处理组比较高氧+CGRP+MW167组Notch1、Hes和HERP蛋白及mRNA表达下降接近高氧组水平(P0.05)。结论1.通过细胞培养实验改良,采用差速贴壁及离心去分离和纯化,培养的AECⅡ,细胞纯度高,活力较前方法好,死亡率低,可用于AECⅡ等相关实验研究。2.通过成功制作高体积分数氧暴露下AECⅡ损伤模型,发现CGRP有部分抗氧化应激的能力,在高体积分数氧的情况下可促进AECⅡ的增殖,对损伤的AECⅡ具有一定的保护作用。3.研究发现Notch信号通路可能参与了高体积分数氧暴露下AECⅡ损伤修复过程,CGRP对损伤后的AECⅡ具有一定的保护作用可能与Notch信号通路的激活有关。
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R722.6;R-332
【图文】：

图 2.1 显微镜下AECⅡ（×10） 图 2.2 台盼蓝染色（×100）Fig 2.1AECⅡunder the microscope(×10) Fig 2.2 Trypan blue staining ofAECⅡ(×100)

显微镜下观察 AECⅡ培养状态良好(见图 2.1)。台盼蓝染色法检测 AECⅡ活力为(95.5±1.6)％(见图2.2)。2.3.2 显微镜下观察 AECⅡ的病理改变及细胞纯度的检测采用巴氏染色后在倒置显微镜下观察，AECⅡ内含板层小体且属于非角化细胞，细胞质成深蓝色或绿色，而角化细胞的细胞质被染成粉红色或橘红色，提示培养分离出来的 AECⅡ是纯的肺泡Ⅱ型上皮细胞，细胞纯度鉴定为（95.7±2.2）％(见图 2.3)。

图2.3：巴氏染色检测大鼠肺泡上皮细胞AEC II纯度(×100)Fig 2.3Modified Papanicolaou stain for detection of AEC II purity in rat alveolar epithelial cells(×100)

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本文编号：2750841