基于Ras-cAMP通路探讨黄芩苷单用或联合氟康唑对白念珠菌生物膜的抑制作用及机制
发布时间：2020-07-29 20:57
【摘要】：目的:探讨中药有效成分黄芩苷单用或联合氟康唑对白念珠菌生物膜的抑制作用及机制。方法:1.采用微量液基比浊法测定念珠菌属的生长曲线;采用微量液基稀释法检测黄芩苷对白念珠菌的MIC和SMIC50;通过透射电子显微镜观察白念珠菌生物膜细胞超微结构;通过碘化丙啶染色观察白念珠菌细胞膜的损伤;通过流式细胞仪测定白念珠菌生物膜细胞周期;通过流式细胞仪检测白念珠菌生物膜细胞ROS和MMP;通过激光共聚焦显微镜观察白念珠菌生物膜细胞磷脂酰丝氨酸外翻与流式细胞仪检测凋亡率;通过荧光显微镜观察白念珠菌生物膜细胞caspase活性;通过DAPI和TUNEL染色检测白念珠菌生物膜细胞DNA损伤和核碎裂;通过紫外分光光度计检测白念珠菌生物膜细胞Cyt C;通过q RT-PCR检测白念珠菌生物膜氧化还原和Ras-c AMP通路相关基因表达的影响;通过Western-blot检测白念珠菌生物膜细胞Ras-c AMP通路相关蛋白的表达情况。2.通过棋盘法考察黄芩苷联合氟康唑对白念珠菌的MIC;通过时间-杀菌曲线检测黄芩苷联合氟康唑对白念珠菌的杀菌作用;以XTT减低法和干重法检测黄芩苷联合氟康唑对白念珠菌生物膜代谢及干重的影响;采用扫描电镜和激光共聚焦显微镜观察黄芩苷联合氟康唑对白念珠菌生物膜形态结构的影响;在液体和固体培养基观察黄芩苷联合氟康唑对白念珠菌芽管及酵母-菌丝转化的影响;检测黄芩苷联合氟康唑对白念珠菌生物膜细胞表面疏水性的影响;通过HPLC检测黄芩苷联合氟康唑对白念珠菌生物膜细胞麦角甾醇合成的影响;通过q RT-PCR检测黄芩苷联合氟康唑对白念珠菌生物膜和Ras-c AMP通路相关基因表达的影响。结果:1.黄芩苷对白念珠菌标准株和临床分离株的MIC值介于500-1000μg/m L之间;黄芩苷诱导白念珠菌生物膜细胞凋亡的作用机制可能是通过影响白念珠菌氧化还原相关基因和Ras-c AMP-PKA通路中相关基因的转录水平和蛋白表达水平,进而影响白念珠菌生物膜细胞的细胞周期和超微结构,阻滞细胞生长周期在S期、导致细胞核固缩和染色体片段化;引起细胞膜PS外翻;破坏线粒体代谢功能,致胞内ROS大量累积、MMP下降、释放Cyt C、激活caspase活性,从而诱导白念珠菌生物膜细胞凋亡。2.黄芩苷与氟康唑联用抗白念珠菌的FICI介于0.28-0.5之间,表现为协同作用,可显著抑制白念珠菌生物膜的形成;SEM和CLSM观察结果验证了以上两药的协同效果。黄芩苷协同氟康唑抗白念珠菌SC5314生物膜作用的机制可能是通过影响白念珠菌黏附和菌丝相关基因、细胞表面疏水性调控基因和麦角甾醇合成调控基因的转录水平,从而抑制芽管形成及酵母-菌丝二相转化、降低表面疏水性和影响麦角甾醇生物合成,产生抗白念珠菌生物膜作用。结论:黄芩苷具有较强的抗白念珠菌效果,其机制涉及影响白念珠菌细胞周期、引起线粒体损伤、激活凋亡依赖性信号途径从而诱导白念珠菌生物膜细胞凋亡;黄芩苷亦可协同氟康唑增强抗白念珠菌作用,通过多途径、多靶点发挥协同抗白念珠菌生物膜作用。本研究为研发新型抗真菌药物并阐明其作用机制提供了实验依据。
【学位授予单位】：安徽中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R379.4
【图文】：
图 1 黄芩苷和氟康唑的结构式(a) 黄芩植物；(b) 黄芩饮片；(c) 黄芩苷结构式；(d) 氟康唑结构式Fig 1 The photo of Scutellaria baicalensis Georgi and its decoction pieces; the structure ofbaicalin and fluconzole.(a) Scutellaria baicalensis Georgi; (b) Decoction pieces of HuangQin; (c) Baicalin ; (d) Fluconazole.
黄芩苷对白念珠菌生物膜的凋亡诱导作用及机制研究3.1 黄芩苷可影响念珠菌属的生长曲线本实验检测了黄芩苷对念珠菌属生长曲线的影响，实验结果显示，黄芩苷浓度介于 125-1000 μg/mL 时，对念珠菌属生长曲线有不同程度的影响。在 0-12 h 内，不同浓度的黄芩苷均能平稳抑制四种念珠菌的生长；而在 16 h 之后，不同浓度的黄芩苷对白念珠菌的生长曲线影响强于其他三种菌。其中，1000 μg/mL 黄芩苷对四种念珠菌属生长曲线影响最明显。本实验说明黄芩苷对念珠菌属均有抑制作用，其中对白念珠菌效果最显著。3 结果
2 透射电镜观察黄芩苷处理后 C. albicansSC5314 生物膜细胞的超微结构空白组；(b) 5 μg/mLAmB；(c) 500 μg/mL 黄芩苷；(d) 1000 μg/mL 黄芩苷. Bar, 200 n 2 Transmission electron micrographs show morphological changes characteristic of apoptoalbicans SC5314cells treated with baicalin . (a) Untreated control; (b) 5 μg/mLAmB; (c) 500mL baicalin; (d) 1000 μg/mL baicalin. Bar, 200 nm.4 黄芩苷对白念珠菌生物膜细胞的膜渗透性的影响碘化丙啶（Propidium iodide，PI）是一种膜不透性染料，常用来标记死细实验发现，1000 μg/mL 黄芩苷只可引起 7.91%的 PI 阳性细胞，即黄芩苷的抗icansSC5314 生物膜机制并非是通过影响细胞膜通透性。
本文编号：2774486
【学位授予单位】：安徽中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R379.4
【图文】：
图 1 黄芩苷和氟康唑的结构式(a) 黄芩植物；(b) 黄芩饮片；(c) 黄芩苷结构式；(d) 氟康唑结构式Fig 1 The photo of Scutellaria baicalensis Georgi and its decoction pieces; the structure ofbaicalin and fluconzole.(a) Scutellaria baicalensis Georgi; (b) Decoction pieces of HuangQin; (c) Baicalin ; (d) Fluconazole.
黄芩苷对白念珠菌生物膜的凋亡诱导作用及机制研究3.1 黄芩苷可影响念珠菌属的生长曲线本实验检测了黄芩苷对念珠菌属生长曲线的影响，实验结果显示，黄芩苷浓度介于 125-1000 μg/mL 时，对念珠菌属生长曲线有不同程度的影响。在 0-12 h 内，不同浓度的黄芩苷均能平稳抑制四种念珠菌的生长；而在 16 h 之后，不同浓度的黄芩苷对白念珠菌的生长曲线影响强于其他三种菌。其中，1000 μg/mL 黄芩苷对四种念珠菌属生长曲线影响最明显。本实验说明黄芩苷对念珠菌属均有抑制作用，其中对白念珠菌效果最显著。3 结果
2 透射电镜观察黄芩苷处理后 C. albicansSC5314 生物膜细胞的超微结构空白组；(b) 5 μg/mLAmB；(c) 500 μg/mL 黄芩苷；(d) 1000 μg/mL 黄芩苷. Bar, 200 n 2 Transmission electron micrographs show morphological changes characteristic of apoptoalbicans SC5314cells treated with baicalin . (a) Untreated control; (b) 5 μg/mLAmB; (c) 500mL baicalin; (d) 1000 μg/mL baicalin. Bar, 200 nm.4 黄芩苷对白念珠菌生物膜细胞的膜渗透性的影响碘化丙啶（Propidium iodide，PI）是一种膜不透性染料，常用来标记死细实验发现，1000 μg/mL 黄芩苷只可引起 7.91%的 PI 阳性细胞，即黄芩苷的抗icansSC5314 生物膜机制并非是通过影响细胞膜通透性。
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 施高翔;严园园;邵菁;汪天明;汪长中;;白念珠菌凋亡诱导研究进展[J];微生物学通报;2014年02期
本文编号：2774486
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