低渗肠内喂养对减轻大鼠NEC模型肠上皮损伤的作用及血常规对未穿孔NEC手术指征的预测

发布时间：2020-07-30 12:40

【摘要】：坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis,NEC)是一常发生于新生儿,其是早产儿的消化道危重症。早产是其发生的最主要危险因素,其他原因包括:胃肠道喂养、肠道缺血、感染及炎性介质失衡。多数学者认为NEC是在肠道异常病原菌定殖的情况下,肠内营养的应用激发了早产极低出生体重儿尚不成熟的上皮细胞产生了过度的炎性反应所致。在喂养相关致病因素中,肠内营养物的选择、何时开始肠道喂养、奶量增加速度都曾被研究,但目前只能确定母乳有预防NEC的作用,故多数机构推荐对早产儿行母乳喂养。然而,仅30%极早产儿母亲可分泌充分母乳。为满足患儿营养需求,多采用配方奶、母乳强化剂、牛(初)乳或母乳库母乳进行喂养;以配方奶喂养最常见。然而,在临床应用中,许多研究者发现早产儿配方奶可能是导致NEC发生的危险因素。除了其缺乏母乳中特异性的免疫性肠道保护因子外,高渗透压可能也与NEC的发生有关。高渗液体可引起肠道损伤早在20世纪70年代已有报道。当高渗肠内营养作用于尚未发育成熟的肠组织,可能会造成肠粘膜损伤;而早产患儿肠上皮屏障还未发育完善,加上细胞防御或免疫功能不足,当上皮屏障功能破坏后可能发生菌群移位,导致细胞介质释放和细胞因子激活,通过级联性炎症反应导致肠道损伤,甚至引发全身性炎症反应综合征。然而,虽然已知人工喂养是早产儿发生NEC的重要危险因需,为避免NEC发生而开奶时间过晚也并不可取。延迟肠内营养可能使胃肠道吸收功能减弱,导致后期喂养不耐受发生。这是因为禁食不能激活肠道激素分泌功能和肠道蠕动能力,从而导致生长迟缓和住院时间延长。微量喂养、缓慢增加奶量是目前较常用的早产儿喂养方式;降低配方奶渗透压,尤其是对存在NEC高危因素如感染、缺氧的早产儿,可能是减轻肠道损伤的一个有意义尝试。在临床工作中,我们已发现以稀释配方奶喂养早产儿可减少NEC的发生率。另有其他研究发现以稀释一倍的配方奶喂养早产或低出生体重儿可使其达到全胃肠道营养的时间明显缩短。目前,配方奶渗透压可能造成肠道何种损伤、通过哪些途径影响肠道功能尚无详细报道;对于无法获得母乳喂养的早产儿,尤其是有缺氧等病理基础的患儿,降低配方奶渗透压是否能减轻肠道损伤及炎症反应也无相关研究。为此,本研究应用不同渗透压奶液进行人工喂养,以缺氧复氧刺激+胃注脂多糖作为应激刺激,比较渗透压在应激条件下对新生大鼠肠道形态学、肠上皮屏障、炎症反应方面的影响,为预防新生儿坏死性小肠结肠炎,尤其是高危患儿提出新的治疗思路。本研究分为以下六部分:研究内容一:建立新生大鼠NEC模型。将60只出生12小时内Sprague Dawley(SD)大鼠平均随机分为3组,分别为(1)鼠乳组,乳母鼠共处哺乳新生小鼠;(2)标准配方奶+缺氧+脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)组;(3)高渗配方奶+缺氧+LPS组。鼠乳渗透压377mOsm/kg;标准配方奶按厂家说明配制,渗透压256mOsm/kg;高渗配方奶增加奶粉浓度至渗透压为512mOsm/kg。低氧通过自制密闭养殖箱,充入纯氮气维持氧浓度5%。LPS按4mg/kg/d经胃灌入。造模时间48小时。此时观察到实验组大鼠出现体重增长缓慢、活动减少、对刺激反应减慢,部分出现皮肤发青、胃潴留等。处死大鼠解剖肠道,可见实验组回肠存在肠管扩张、弹性差、肠壁淤血及肠壁积气现象;结肠主要表现为肠壁积气。HE染色可见实验组末端回肠绒毛脱落、绒毛缩短、固有层与肌层分离、肠壁淤血等NEC样改变,部分可见炎细胞浸润。证明人工喂养+缺氧+LPS诱导48小时新生大鼠的NEC模型建立成功。研究内容二:为观察降低配方奶渗透压是否可减轻对肠上皮的损伤,我们设立低渗配方奶+缺氧+LPS组,以稀释配方奶(渗透压128mOsm/kg)喂养大鼠。采用HE染色观察大鼠肠上皮组织学形态,并与鼠乳组、标准组、高渗组进行比较。同时通过透射电镜观察各组在超微水平下的绒毛形态、细胞器、紧密连接蛋白的特点。结果显示,生后48小时时,与标准组及高渗组相比,低渗组大鼠一般情况及肠道大体病理变化较轻,上皮绒毛长度较长,肠上皮病理损伤程度降低;电镜下见肠上皮细胞微绒毛损伤程度较轻、紧密连接长度较短。说明低渗喂养能减轻大鼠回肠上皮组织学损伤。研究内容三:使用免疫荧光(immunofluorescence,IF)、荧光定量反转录聚合酶链反应(reverse transcriptase-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)和蛋白质免疫印迹法(Western Blot,WB)方法检测新生大鼠NEC模型中闭锁小带蛋白-1(zonula occluden-1,ZO-1)、闭合蛋白(Occludin)表达情况。IF及WB检测发现大鼠回肠中ZO-1、Occludin在蛋白水平表现为鼠乳组低渗组标准组高渗组。ZO-1的mRNA表达水平为鼠乳低渗/标准高渗,其中低渗组和标准组无差异;Occludin的mRNA水平为鼠乳低渗标准高渗。此结果说明低渗可减轻NEC时肠道紧密连接蛋白的破坏,从而保护肠道屏障功能。研究内容四:使用免疫组化(immunohistochemical,IHC)、RT-qPCR方法检测新生大鼠NEC模型中粘液蛋白2(mucin2,MUC2)表达,结果显示其mRNA水平为低渗组标准组高渗组鼠乳组,差异有统计学意义(p0.05)。而通过软件分析IHC切片发现在蛋白水平鼠乳组低渗组标准组高渗组。这提示实验条件下低渗组MUC2蛋白表达高于标准、高渗组,可能与其mRNA转录水平活跃有关。研究内容五:为研究低渗通过何种机制减轻肠上皮损伤,我们检测不同处理组核转录因子(nuclear factor kappa B,NF-κB)情况。我们用WB分析NF-κB p65蛋白表达水平,利用免疫荧光检测NF-κB p65在细胞内的表达及分布。WB结果显示,低渗组NF-κB p65蛋白表达与鼠乳组无明显差别,而低渗组标准组高渗组,差异有统计学意义。说明低渗喂养可能通过减轻肠上皮细胞的NF-κB p65的激活起到保护作用。研究内容六:以45例手术治疗病例(手术组)及43例保守治疗好转病例(保守组)为研究对象,两组患儿发病前(T0)、NEC起病时(T_1)、手术组手术前(T_2)(保守组发病后36h)的白细胞计数(white blood cell count,WBC)、血小板计数(platelet count,PLT)及C反应蛋白水平(C-reactive protein,CRP)分别记为WBC_0、PLT_0、CRP_0、WBC_1、PLT_1、CRP_1及WBC_2、PLT_2、CRP_2。对各变量进行Manner-Whitney U检验,其中存在差异变量采用Logistic回归及受试者工作特性曲线(receiver operating curve,ROC)分析。结果发现两组间WBC_2、PLT_2、CRP_2差异有统计学意义(p0.05)。通过回归分析发现WBC_2和PLT_2是手术的独立因素,回归方程为ln(P/(1-P))=2.725-0.191WBC_2-0.007PLT_2,其中P代表预测手术概率(predictive probability,P)。ROC分析用由WBC_2和PLT_2构成的回归方程预测手术的曲线下面积可达到83%,预测概率P的最佳诊断界值为0.55,此时敏感性83%,特异性81%。此预测概率P在验证组中敏感性和特异性分别84%和86%。总之,本研究证实了我们的实验设想,低渗配方奶可减轻人工喂养+缺氧复氧刺激+LPS联合刺激下新生大鼠的肠道损伤,并对其可能的机制进行了初步探讨,这为探寻临床NEC高危患儿的肠道喂养方式提供了理论依据。另外,通过临床数据分析,发现了血常规指标的联合应用可判断未穿孔NEC患儿是否需要手术。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R-332;R726.5
【图文】：

鼠乳,标准组,高渗,大鼠

肠上皮损伤的作用及血常规对未穿孔NEC手术指征的预测- 15 -图1 造模结束后鼠乳组、标准组、高渗组大鼠外观。A、D：鼠乳组，外观正常，活动自如，皮下脂肪丰满；B、E：标准组，皮肤发青，活动力下降，皮下脂肪薄；C、F：高渗组，皮肤发青，活动力下降，皮下脂肪薄，部分大鼠胃内可见奶液潴留。（二）人工喂养+缺氧+LPS处理NEC模型建立效果1、大体病理鼠乳组大鼠空肠为乳白色，回肠呈淡黄色，弹性好，无积气、积液出现。实验组部分大鼠出现肠管扩张、肠壁淤血或肠壁积气；损伤以结肠最重，回肠次之，而空肠损伤较轻。通过解剖发现，肠道大体形态改变符合NEC表现（图2）。根据Zani[25]对大鼠肠道大体病理评分

形态图,形态,绒毛,隐窝

图2.各组大鼠肠道大体形态。A：鼠乳组，肠道形态正常；B：等渗组，回肠扩张、性差，肠壁积气；C：高渗组，末端回肠及结肠肠管广泛扩张、积气；D：标准组肠腔内可见气泡；E：高渗组，肠壁明显积气，肠壁变薄。（↑为肠壁积气）2、组织学改变鼠乳组大鼠回肠结构完整，肠黏膜完整连续，腺体排列规则，分泌功能活跃。绒毛多而细长，呈指状或叶状向肠腔内突入，绒毛表面由单层柱状上皮细胞覆盖，皮结构完整，细胞排列整齐，胞核深染，隐窝丰富；未见充血水肿、分离断裂等，分可见炎性细胞浸润。实验组表现为肠壁变薄，绒毛缩短增宽，可见绒毛坏死脱落致绒毛参差不齐；隐窝数量减少、结构紊乱，部分隐窝裸露；固有层与肌层分离；分肠壁可见出血。上皮细胞肿胀，呈空泡样，胞浆淡染，绒毛顶端的上皮细胞变平/或脱屑，可见细胞核固缩。各组大鼠肠道组织学形态见图3。

绒毛,鼠乳,标准组,高渗

肠上皮损伤的作用及血常规对未穿孔NEC手术指征的预测- 17 -图3. 各组大鼠的肠道组织HE染色结果（A~C：100×；D~F：200×）A、D：鼠乳组，绒毛细长，排列规则，上皮细胞呈柱状；B、E：标准组，绒毛缩短、脱落；C、F：高渗组，绒毛参差不齐，可见固有层与肌层分离（↑）。每组各选取3张HE染色切片，光镜调至10×10倍，测量视野中绒毛高度，取其平均值，进行统计学分析。结果为：绒毛高度（单位um）：对照组178±5.8

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