朊病毒在小鼠和仓鼠之间传播屏障的分子机制研究

发布时间：2020-08-03 13:19

【摘要】：目的:朊病毒疾病是由朊蛋白错误折叠引起的一类神经退行性疾病,也称为传染性海绵状脑病。错构的朊蛋白结构中α螺旋结构比例下降,β折叠结构比例上升,造成这种错构朊蛋白积聚成纤维状,引发神经细胞的凋亡。这种错构的朊蛋白被称为朊病毒,可通过食物、血液等在动物中传播,进入宿主内的朊病毒可诱导宿主正常朊蛋白错构,从而完成疾病的传染。朊病毒在小鼠和仓鼠之间传播具有屏障作用,表现为实验动物的发病的潜伏期延长,发病率低下。除了株系的原因之外,朊病毒的传播屏障主要是由异源朊蛋白的氨基酸位点的差异造成的。小鼠和仓鼠存在11个氨基酸位点的不同,且每个位点对小鼠和仓鼠之间朊病毒传播的影响程度不同。我们在仓鼠朊蛋白的基础上构建了不同的向小鼠朊蛋白氨基酸突变的多位点突变体朊蛋白,利用PMC A技术和体外重组朊蛋白技术,探究不同位点组合能否跨越朊病毒在小鼠和仓鼠之间传播的种属屏障。方法:在合成的质粒模板上,设计多个位点的突变引物,由仓鼠向小鼠突变。得到的突变载体模板经测序正确后,转化进BL21大肠杆菌,挑选单克隆并进一步诱导表达重组朊蛋白。将得到的重组朊蛋白与小鼠朊病毒(PrP~(Sc))一起进行PM CA实验,观察小鼠朊病毒能否诱导多点位突变仓鼠朊蛋白产生错构,通过PK消化处理PMCA产物检测其PK抗性进行验证。结果:成功构建了7个多点突变的重组朊蛋白基因,其中包括4个3突变位点、2个4突变位点和1个5突变位点。经测序正确后,转化大肠杆菌诱导表达,经过Ni-NTA亲和层析后得到重组蛋白。在配制底物体系后,与小鼠PrP~(Sc)进行P MCA实验,检验转化结果。结果显示HaPrP(M111V-M138I-I204M)转化的构象得到了经PK消化后具有致病能力的17 kD片段,其他突变体都出现了经PK消化后的无致病能力的14 kD片段。结论:PMCA结果显示,经过PK消化后,在7种突变体里面只有HaPrP(M111V-M138I-I204M)这个突变体得到了17 kD片段的致病构象,没有出现无致病的14 kD片段无致病构象。而其他3突变体及更多位点的4突变体和5突变体既得到经PK消化的无致病构象14 kD片段也得到了经PK消化有致病构象的17 kD片段,这2种不同构象的同时存在可能不会使接种的动物患病,无法实现跨越种属屏障。同时M111V、M138I和I204M与先前得到的影响小鼠-仓鼠朊病毒传播的G54ins、I138M和M204I 3个位点结果并不完全一致。说明单个氨基酸位点作用并不是简单的叠加效果,有可能这些位点还存在空间上的相互作用。本文通过重组朊蛋白和PMCA技术,得到了克服小鼠和仓鼠种属屏障的3突变朊蛋白,阐述了小鼠和仓鼠朊病毒种属间传播的关键氨基酸位点,进一步验证了构象选择理论。
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R373
【图文】：

于蛋白质一级结构。除了氨基酸位点的不同之外，越来越多的研究表明朊病毒株系在传播屏障里起重要作用。典型例子便是变异型克雅氏病 （variant CJD，vCJD）和散发型克雅氏病（sporadic CJD，sCJD）对小鼠朊蛋白和人朊蛋白的不同传染特点。两者的氨基酸序列一致，vCJD 是通过 BSE 传染得到的，而 sCJD 是自发形成的，两者表现出不同的株系特点。其中，sCJD 可以稳定传染给表达人源朊蛋白的转基因小鼠，但不能传染给野生型小鼠；而 vCJD 可以高效传给野生型小鼠朊蛋白[20]。此类发现引出了构象选择学说[21-22]。该学说指出，所有的朊蛋白聚集体，只有一部分与宿主相兼容的才能在宿主体内具有致病作用。两个物种之间兼容构象的重叠度解释了传播屏障的产生。在这个理论模型下，种属屏障基本上和株系相关。传播屏障也会由于同一物种的朊蛋白的多态性而发生，比如人类的 129 位点甲硫氨酸或缬氨酸的不同也会影响朊病毒的传染和株系选择[23]。

有 10 个氨基酸位点不同。正是这些氨碍。框架，向仓鼠方向突变，构建 11 个小蛋白一起混合，放在 PMCA 条件下孵（图 1.1）。说明不同氨基酸位点在小揭示了小鼠朊病毒和仓鼠朊病毒传播204I 和 I138M 突变影响最大。鼠为框架，构建向小鼠方向突变的多位 PrPSc作为种子，进行孵育得到具有致病毒和仓鼠朊病毒之间的传播屏障。由鼠朊蛋白片段的质粒后，我们设计了 5

15图 1.5 点突变 PCR 产物鉴定Figure 1.5 Identification of site mutation PCR production合成的 pET-22b-HaPrP23-231 质粒上，为得到多突变体，我们设在每一轮单点突变后，挑 3 个单克隆菌落送测序，将得到的正确

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本文编号：2779688