DDA复合物脂质体流感疫苗鼻黏膜免疫效应及作用机制探讨

发布时间：2020-08-15 00:00

【摘要】：目的流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病,严重危害人类健康,接种流感疫苗仍是现阶段预防流感最有效的措施。现用流感疫苗多为灭活疫苗,其副反应多且免疫原性差,为提高疫苗的安全性及免疫原性,本研究选择DDA阳离子脂质作为疫苗佐剂,构建DDA复合物脂质体流感疫苗,以期通过鼻黏膜免疫获得较高的免疫效力,从而有效预防流感,为新型疫苗及其佐剂的开发提供有价值的参考。方法1以DDA阳离子脂质作为脂质膜的主要成分,以中性磷脂DSPC作为辅助脂质,TPGS及PEG作为免疫调节剂,通过薄膜分散法制备DDA-DSPC、DDA-DSPC-TPGS和DDA-DSPC-PEG脂质体并包载流感抗原,考察粒径、Zeta电位、包封率(EE)、载药量(LE)等重要指标,对所制备的各脂质体流感疫苗进行特性评价。并通过筛选冻干保护剂及冻干条件,对脂质体流感疫苗的冻干处方及工艺进行初步探索。2体外培养小鼠骨髓树突状细胞(BMDCs),通过细胞毒性试验考察DDA阳离子脂质体复合物对树突细胞的毒性,通过流式细胞仪(Flow Cytometer,FCM)考察未成熟BMDCs对包载荧光标记蛋白的不同脂质体的摄取情况,评价不同脂质体与抗原提呈细胞(APCs)相互作用并呈递抗原的能力。并以MHCII、CD80、CD86为指标,考察各组脂质体流感疫苗刺激DC2.4细胞分化成熟的能力。3以C57BL/6小鼠为动物模型,通过鼻黏膜免疫,采用酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测小鼠黏液分泌型IgA(sIgA)、血清IgG1及小鼠脾脏细胞因子IFN-γ、IL-4的表达水平,对DDA复合物脂质体流感疫苗的免疫效应进行初步评价。结果1采用薄膜分散法制备的脂质体流感疫苗,分散介质为pH7.4的Tris-buffer,所得DDA-DSPC脂质体流感疫苗粒径685.0±17.8 nm,PDI 0.522±0.342,zeta电位25.4±1.9 mV,EE 65.7±2.0%,LE 6.2±0.2%;DDA-DSPC-TPGS脂质体流感疫苗粒径337.3±2.4 nm,PDI0.555±0.061,zeta电位15.4±2.1 mV,EE 78.5±1.5%,LE 4.2±0.2%;DDA-DSPC-PEG脂质体流感疫苗的粒径591.4±19.3 nm,PDI 0.470±0.023,zeta电位6.9±0.8 mV,EE 45.8±3.0%,LE 3.0±0.3%。透射电镜观察,以上各组脂质体疫苗外观均呈圆球形或椭球形。此外,通过对脂质体疫苗进行冻干处方及工艺的考察,优化得到脂质体疫苗冻干的最佳处方为5%的蔗糖和5%的乳糖按质量比1:1合用,冻干条件为预冻温度-80℃,预冻时间8 h,在此条件下脂质体疫苗冻干效果比较良好。2体外摄取实验结果显示未成熟的BMDCs和DC2.4与包载FITC-BSA的各组脂质体孵育2小时后,DDA-DSPC脂质体组摄取率最高,与其他各组相比,有极显著性差异(p0.01)。游离抗原FITC-BSA组摄取率最低,其他两组DDA-DSPC-TPGS和DDA-DSPC-PEG组摄取率低于DDA-DSPC组,但与抗原组相比,均有一定程度的提高。DCs细胞成熟实验结果显示,各组DDA复合物脂质体均能显著上调DCs表面共刺激分子CD86及MHC-II的表达水平(p0.05),表明DDA复合物脂质体能够促进DCs的分化成熟。3 DDA-DSPC组脂质体流感疫苗经鼻黏膜免疫后,可显著提高鼻黏液中IgA抗体滴度,DDA-DSPC-TPGS组脂质体流感疫苗可显著提高血清IgG1及小鼠脾脏细胞因子IFN-γ的表达水平(p0.05),但各组脂质体流感疫苗均未有效诱导IL-4的表达。结论采用薄膜分散法制备了包封率较高的DDA复合物脂质体流感疫苗,外观呈圆球形或椭球形,并对其冻干处方及工艺进行了初步考察。体外摄取实验结果显示,DDA复合物脂质体能够提高DCs对其的摄取,尤其是DDA-DSPC组,其摄取效果明显高于其他两组。DCs成熟实验结果显示,和抗原组相比,DDA复合物脂质体能够上调DCs表面共刺激分子CD80、CD86及MHC-II的表达水平,表明DDA复合物脂质体能够刺激诱导DCs分化成熟。动物实验结果显示,三组DDA复合物脂质体流感疫苗经鼻黏膜免疫后,能够诱导较高水平的血清IgG1抗体、鼻黏液IgA抗体及IFN-γ,体现了DDA复合物脂质体良好的佐剂特性,尤其是DDA-DSPC-TPGS组脂质体流感疫苗,其诱导的小鼠血清IgG1及脾细胞分泌上清中IFN-γ的表达水平高于其他各组,表明TPGS具有一定的免疫调节作用。
【学位授予单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392
【图文】：

图 1 蛋白含量测定标准曲线Figure 1 The standard curve of the concentration of protein.量的测定稀释抗原原液及待测样品上清液，根据 BCA 法测定蛋白质

2 脂质体流感疫苗的 TEM 图 a) DDA-DSPC 脂质体流感疫苗，b) DDA-DSPC-TPGS质体流感疫苗，c) DDA-DSPC-PEG 脂质体流感疫苗gure 2 TEM of a) DDA-DSPC liposomes influenza vaccines，b) DDA-DSPC-TPGS liposinfluenza vaccines and c) DDA-DSPC-PEG liposomes influenza vaccines

图 1 第 7 天树突状细胞倒置显微镜观察（a：10 倍镜；b：40 倍镜）ure 1 The cultured cells showed dendritic structure under inverted microscope at the 7thd10×; b: 40×）BMDCs 表面 CD11c 的表达结果

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本文编号：2793716