去泛素化酶BAP1在抗病毒天然免疫应答中的作用与机制研究

发布时间：2020-08-20 18:44

【摘要】：作为机体抵抗病原微生物入侵的第一道防线,天然免疫系统主要通过一系列模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)识别结构上较保守的病原体相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)或探测自身异常细胞来源的危险相关分子模式(danger associated molecular pattern,DAMP)以监控病原体感染或感知细胞生存压力。模式识别受体被激活后将进一步活化相应下游信号通路,最终激活NF-κB、AP-1和IRF等转录因子以驱动炎性细胞因子、趋化因子及干扰素的转录活化,杀伤并清除入侵病原体或自身异常的组织细胞,保护机体健康。翻译后修饰(post-translational modification,PTM)是蛋白质功能调控的重要方式,其中泛素化修饰由E1-E2-E3泛素酶系统与去泛素化酶共同调节,在抗原提呈、细胞分化、免疫防御与炎症等诸多免疫过程中扮演重要角色。泛素是由76个氨基酸残基构成的高度保守的小分子多肽,单体分子量为8.6kDa,可通过本身Lys 6、11、27、29、33、48、63七个赖氨酸残基或头尾相连形成线性泛素化修饰。目前研究最为成熟的是介导蛋白酶体途径降解的K48连接泛素化修饰以及与蛋白激酶活化相关的K63连接泛素化修饰。去泛素化酶能够与泛素修饰系统共同调控某一蛋白位点的泛素化水平,由于泛素可以多种方式多聚化偶联,在蛋白质功能调节过程中作用广泛且重要。去泛素化酶分类上属于蛋白水解酶超家族,家族成员众多,绝大多数为半胱氨酸蛋白酶,但功能和机制研究仍然不十分完善,其在天然免疫应答调控中的作用仍有待进一步研究。在本课题中,我们通过去泛素化酶家族小干扰RNA(siRNA)文库去筛选并试图发现在天然免疫细胞抗病毒感染模型中具有显著功能的潜在研究对象。针对筛选体系所采用的VSV、SeV和HSV-1感染模型,我们分别筛选得到了一系列调控抗病毒天然免疫信号的潜在研究对象,其中一些已被报道并与我们所筛选得到的效应一致,这印证了我们筛选体系的可行性。对于大部分在天然免疫调控研究领域尚未被报道的去泛素化酶基因,我们优先选择在不同种类病毒感染模型中具有一致且最显著差异表型的BRCA1相关蛋白1(BRCA1-associated protein 1,BAP1)作为研究对象,以期发现具有普适性的天然免疫抗病毒调控机制。已有研究表明BAP1参与了细胞周期、分化、转录和DNA损伤修复等许多重要生命过程,而BAP1的突变会提高黑色素瘤、间皮瘤、肾细胞癌等多种恶性肿瘤的发病几率,但BAP1在天然免疫应答调控的作用尚不清楚,值得进一步研究。通过体外功能实验,我们发现BAP1能够显著上调病毒感染与外源性核酸模拟物诱导的I型干扰素的表达和分泌,增强细胞抗病毒感染能力并显著抑制病毒胞内复制增殖。由于BAP1基因缺陷小鼠胚胎致死,即使髓系特异性敲除也会引发髓系细胞白血病,因而我们尝试利用慢病毒感染野生型小鼠肺脏的方法构建了BAP1肺脏特异性过表达及敲低小鼠模型。通过体内肺脏流感病毒感染模型,我们发现BAP1能够诱导I型干扰素与炎症因子的分泌并增强干扰素刺激基因的表达,从而抑制流感病毒在肺脏的复制增殖。此外,BAP1可以缓解流感病毒感染导致的肺组织炎性细胞浸润及小鼠体重减轻,能够延长致死剂量感染小鼠的生存期并提高其生存率。在机制研究中,通过干扰原代巨噬细胞中BAP1的表达,我们发现,BAP1的表达下调会显著抑制病毒感染诱导的IRF3的磷酸化而对其他信号通路分子无明显影响。通过荧光素酶报告基因实验我们发现,BAP1能有效增强IRF3及其上游信号通路分子诱导的IFNβ基因表达的活化。通过构建BAP1截短体结合报告基因实验,BAP1对IFNβ基因表达的活化效应依赖于其泛素化酶活性及核定位。进一步实验发现,BAP1能够促进病毒刺激下IRF3二聚化及核转位。利用外源性免疫共沉淀筛选信号通路分子,BAP1能够与IRF3显著相互作用,我们进一步在原代巨噬细胞中验证了内源性BAP1与IRF3的结合。利用BAP1截短体进行免疫共沉淀实验,结果表明BAP1与IRF3的相互作用主要依赖于BAP1 UCH-H区域。接下来的实验证明,BAP1的表达降低会促进IRF3蛋白酶体途径降解,并进一步验证BAP1能够下调IRF3 K48泛素化修饰水平而对其他类型泛素化修饰无明显影响。为了进一步明确BAP1的作用机制,我们利用分离胞浆胞核组分后免疫共沉淀的方式发现二者均见BAP1与IRF3的相互作用,但胞核中结合随病毒感染增强。值得注意的是,我们发现病毒感染诱导的IRF3 K48泛素化修饰主要发生在胞核组分中,并且BAP1主要抑制胞核中IRF3的降解。进一步实验发现,能与IRF3相互作用且具有去泛素化酶活性的BAP1 UCH-H截短体由于缺乏入核能力并不能有效抑制核内IRF3的K48泛素化修饰及降解。查询已有文献报道,未见IRF3 K48泛素化修饰明确位点,因此挑选人鼠间保守的14个潜在泛素化赖氨酸位点构建Lys-Arg点突变体。实验结果表明Lys77和Lys87是IRF3 K48泛素化修饰的关键位点,突变后显著抑制IRF3降解,构建双位点突变体后实验发现,IRF3 K77/87R双位点突变较K77R K87R单位点突变进一步抑制IRF3降解并增强IFNβ报告基因的活化,但对病毒感染诱导的IRF3核转位无明显差异。利用野生型及单、双位点IRF3突变体进行免疫共沉淀实验发现,过表达BAP1可以下调WT IRF3及IRF3 K87R点突变体K48泛素化修饰水平而对IRF3 K77R及K77/87R突变体K48泛素化修饰水平无明显影响,这一结果提示BAP1特异性作用于Lys77位点去泛素化修饰。为了进一步明确负责IRF3 Lys77位点K48泛素化修饰的E3泛素连接酶,我们筛选已被报道IRF3 K48连接泛素化修饰E3,发现UBE3C能够显著增强Lys77位点的泛素化水平,TRIM26能够增强Lys87位点的泛素化水平。在病毒感染早期BAP1明显升高而在后期逐渐恢复正常水平,而UBE3C表达水平晚于BAP1也有所升高并最终恢复到正常水平。我们的研究提示,在病毒急性感染期,BAP1表达升高并抑制核内IRF3 K48连接泛素化修饰介导的降解以放大抗病毒免疫效应;在感染后期,UBE3C表达逐渐增高并逆转BAP1的促炎效应,使IRF3活化恢复到正常水平以免过度应答损伤机体。综上所述,本研究发现了抑癌基因BAP1正向调控抗病毒天然免疫应答的新功能,鉴定出抗病毒天然免疫信号通路中关键转录因子IRF3上能够被K48泛素化修饰的位点Lys77和Lys87,同时揭示了E3泛素连接酶UBE3C能够与BAP1拮抗调节IRF3的新机制,进一步完善了IRF3表达水平与功能的调控网络,同时也为进一步理解BAP1的抑癌机制提供了新思路,为干预癌症与病毒感染提供了潜在作用靶点。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R392
【图文】：

pcDNA3.1/Myc(-)B质粒图谱

pMIR-REPORT质粒图谱

pRL-Renilla-TK荧光素酶内参质粒图谱

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本文编号：2798315