Golgi-Cox染色鼠脑神经元的荧光成像

发布时间：2020-08-22 02:43

【摘要】：在脑连接组学,尤其是脑疾病异常神经回路连接的研究中,高尔基染色作为经典的标记工具,它仍是当前灵长类动物大脑,以及人脑标记中最为常用的手段。被高尔基方法染色的样本在制备中通常需要使用切片机将毫米厚的脑组织切成微米厚的脑片,但是,受到振动切片机或冰冻切片机切削厚度的影响,用于脑神经元成像的脑片厚度局限在10微米以上。在宽场或共聚焦显微镜中,脑片过厚会导致三维数据重建存在一定的缺断或不完整性。而刀面扫描显微镜虽然可以进行1微米厚度的切片成像,但是存在成像速度慢的缺点。因此,发展基于高尔基染色全脑的三维快速层析成像方法成为当前研究的热点。 高尔基染色被广泛应用于神经元的标记中,但是对其染色机制,一直未得到准确的解释。对Golgi-Cox染色神经元上析出物的分析,是解释其染色机制的物质基础。但是,由于传统光学成像手段,如宽场透射成像和共聚焦反射成像,存在不能进行成分分析的缺点,而其它化学检测手段存在不能准确定位到被染色神经元,或不能提出被染神经元上的析出物的缺点,从而导致对高尔基染色后神经元上析出物的成分分析存在困难。因此,采用新的成像方法,并结合多种表征手段对Golgi-Cox染色鼠脑神经元的析出物进行成分分析,可以研究Golgi-Cox染色鼠脑神经元的机制。 本文旨在探索适合Golgi-Cox染色鼠脑神经元的荧光成像方法,并结合多种表征手段对被染神经元上的物质进行成分研究,拓展高尔基标记脑神经元的应用,并促进对高尔基染色机制的理解。 首先,本文研究了Golgi-Cox染色鼠脑神经元的单光子荧光成像方法。本文对经改良的Golgi-Cox染色法制备全脑样品的背景进行荧光光谱分析,提出Golgi-Cox染色鼠脑神经元的荧光成像原理。通过Golgi-Cox染色鼠脑神经元的共聚焦荧光成像和宽场荧光成像的实验验证了原理。通过对比荧光成像方法与经典的宽场透射成像方法,发现荧光成像能抑制背景干扰。该荧光成像方法在Golgi-Cox染色鼠脑神经元的研究中能区分已染色神经元和未染神经元的胞体。 接着,本文将Golgi-Cox染色鼠脑神经元的宽场荧光成像拓展为了宽场荧光层析成像。根据宽场荧光显微镜和“先成像后切片”的成像策略,论证了宽场荧光层析成像的可行性。通过对采集的数据结合算法处理,本文获得了Golgi-Cox染色鼠脑神经元宽场荧光层析的三维图像。 随后,本文通过双光子荧光成像观察到Golgi-Cox染色鼠脑神经元的双光子荧光现象及荧光特性。并结合显微红外光谱探讨了Golgi-Cox染色鼠脑神经元发射荧光的机理。结合扫描电子显微镜、环境扫描电子显微镜、X射线能谱分析、X射线光电子能谱分析,本文对Golgi-Cox染色神经元上的析出物进行形貌、元素以及价态、官能团的分析,得出析出物的成分,推测出汞蛋白与Golgi-Cox染色机制的关联和Golgi-Cox染色碱化过程前后的析出物。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R338

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本文编号：2800167