NOVA1在脂肪间充质干细胞成脂分化过程中的转录激活及其作用研究

发布时间：2020-08-23 16:56

【摘要】：研究背景RNA 结合蛋白 Noval(neuro-oncological ventral antigen 1)是神经特异性剪接因子。随着研究的深入,人们发现Noval对肿瘤预后、能量代谢也有影响,并在脂肪组织也具有较高的表达。我们的前期研究发现,脂肪来源的间充质干细胞(Adipose Tissue-Derived stem cells,ADSCs)成脂分化的过程中NOVA1基因表达升高,敲减NOVA1能够抑制脂肪分化。本研究将进一步探讨在ADSCs成脂分化过程中NOVA1的激活机制及其促进脂肪分化的机制。研究目的1.探讨脂肪特异转录因子对NOVA1的转录调控作用。2.发现Nova1调控成脂分化的靶分子。研究方法和结果1.脂肪特异转录因子对NOVA1的转录调控作用。方法:双萤光报告检测脂肪特异转录因子对NOVA1启动子的转录调控作用,染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)检测 ADSCs 中 PPARy在NOVA1启动子的富集,实时定量PCR检测在ADSCs中过表达或激活PPARγ对NOVA1表达的调控。结果:PPARγ:RXRa转录因子复合物通过识别PPARγ应答元件(Peroxisome Prolifertors Responsive Element,PPRE)转录激活NOVA1启动子;PPARy在NOVA1启动子区PPRE附近有显著富集;激活或过表达PPARγ后NOVA1的表达升高,PPARγ拮抗剂和抑制态PPARy能够逆转NOVA1的表达升高。2.Nova1调控脂肪分化的靶分子。方法:全转录组表达谱芯片、生物信息学分析和实时定量PCR筛选出Noval调控的脂肪特异基因;敲减靶基因并成脂诱导,油红O和实时定量PCR检测对脂肪分化的影响;敲减NOVA1的基础上过表达靶基因,成脂诱导后油红O和实时定量PCR检测对脂肪分化的影响。结果:Noval能影响PPARy下游基因ACSL1、CD36、FASN、PLIN1的表达;敲减CD36、FASN、PLIN1都能抑制脂肪分化;过表达FASN或PLIN1都能够部分挽救敲减NOVA1对脂肪分化抑制作用。研究结论1.PPARγ:RXRα转录因子复合物促进NOVA1基因的转录。2.Nova1通过影响FASN、PLIN1基因的表达调控ADSCs成脂分化。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R329.2
【图文】：

萤火虫,萤光素酶,转录因子,萤光

逦４．实验结果逡逑４．１邋ＰＰＡＲＹ：ＲＸＲａ转录因子复合物对启动子的转录激活逡逑通过对ｉＶＯ以７启动子进行生物信息学分析，我们发现Ｍ９以７启动子区存在逡逑Ｃ／ＥＢＰｓ、ＧＡＴＡｓ、ＳＲＥＢＰｌｃ、ＰＰＡＲｙ、ＲＸＲｃｕ邋ＰＰＡＲｙ：ＲＸＲｃｉ邋等月旨肪特异转录因子可逡逑能的结合位点。我们将以／的启动子区克隆在ｐＧＬ４．１０质粒萤火虫萤光素酶基逡逑因（Ｉｗｃ和ｒａｓｅ）的上游，构建了邋＃０权７启动子萤光报告质粒——ＮＯＶＡｌ－Ｌｕｃ邋ｉＷｉ逡逑１邋－１邋Ａ）。萤光双报告检测脂肪特异转录因子ＣＥＢＰａ、ＣＥＢＰＰ、ＣＥＢＰＳ、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３、逡逑ＳＲＥＢＰｌｃ、ＰＰＡＲｙ、ＲＸＲａ、ＰＰＡＲｙ：ＲＸＲａ对７ＶＯ⑶启动子的转录调控作用。结果逡逑显示，只有ＰＰＡＲｙ：ＲＸＲａ转录因子复合物能显著提高加９以７－Ｚｗｃ的萤火虫萤光素逡逑酶相对活性。ＰＰＡＲｙ对的萤火虫萤光素酶相对活性有微弱的促进作用，逡逑而邋ＣＥＢＰａ、ＣＥＢＰｐ、ＣＥＢＰ５、ＧＡＴＡ２、ＧＡＴＡ３、ＳＲＥＢＰｌｃ、ＲＸＲａ邋对逦以７－Ｚｗｃ邋的逡逑萤火虫萤光素酶相对活性无显著促进（图ＭＢ）。由此说明，ＰＰＡＲ＾ＲＸＲｏｔ转录因逡逑子复合物对以ｉ启动子具有转录激活作用。逡逑

序列,转录因子,转录调控,复合物

邋Ｐｒｏｍｏ邋ｔｏ－的上游，构建成报告基因质粒逦ＰＰＲＥ－ｍｉｎｉＰ－Ｌｕｃ邋＞邋ＰＰＲＥｍ－ｍｉｎｉＰ－Ｌｕｃ逡逑（图１－２Ｂ）。萤光双报告实验检测ＰＰＡＲｙ：ＲＸＲａ转录因子复合物对ＰＰＲＥ、ＰＰＲＥｍ逡逑的转录调节作用，结果显示ＰＰＡＲＹ：ＲＸＲａ能显著提高的萤火虫萤逡逑光素酶相对活性，而对ｚｍ＇ｍ＇Ｐ－Ｚｗｑ／ｅｒａｓｅ、的儢火虫萤光素酶相对逡逑活性无显著促进作用（图１－２Ｄ）。因此证明，ＰＰＡＲＹ：ＲＸＲａ转录因子复合物可以识逡逑别ＰＰＲＥ激活下游启动子的转录。逡逑我们根据以７启动子区设计了邋４组不同片段序列，每组序列包含不同的启逡逑动子区域，以及ＰＰＲＥ的有无。一共８个序列，分别克隆到ｐＧＬ４．１０质粒Ｌｗｃｚ／ｅｒａｓｅ逡逑基因上游，构建成萤光报告质粒——Ｓ／－Ｚｗｃ？Ｓ＆Ｌｗｃ？（图１－２邋Ｅ）。萤光双报告检测逡逑ＰＰＡＲＹ：ＲＸＲ（ｘ转录因子复合物对切启动子不同片段的转录调控作用。结果显逡逑示ＰＰＡＲｙＲＸＲａ转录因子复合物能显著提高含有ＰＰＲＥ的Ｓ／－Ｌｗｃ、ＳＨｗｃ、Ｓ５－ｉ：ｗｃ、逡逑Ｓ７－ｋｃ的萤火虫萤光素酶相对活性，缺失ＰＰＲＥ的Ｓ２－Ｌｗｃ、Ｓ４－Ｌｗｃ、Ｓ＜５－Ｌｗｃ逡逑的萤火虫萤光素酶相对活性无显著促进（图１－２Ｅ）。以上结果说明

区域图,内启动子,启动子区,黑色

ＡＤＳＣｓ中ＰＰＡＲ７能否与７ＶＯ以ｉ启动子区特异结合，我们通过染色质免疫共沉淀实逡逑验和实时定量ＰＣＲ检测ＰＰＡＲｙ在ＰＰＲＥ附近的富集。在的ＰＰＲＥ附近和逡逑Ｉｎｔｒｏｎｌ，各自设计ｑＰＣＲ引物（图１－３Ａ），结果显示ＰＰＡＲｙ在ＰＰＲＥ的富集度是其逡逑在ＩＮＴＲＯＮ区的１９倍；而普通ＩｇＧ在２个区域的富集度比仅为１．９（图１－３Ｂ）。由逡逑此说逡逑Ａ逡逑ＰＰＲＥ逦Ｅｘｏｎｌ逦Ｉｎｔｒｏｎｉ逡逑ＮＯＶＡＩｇｅｎｅ逦＾＾＾逦逡逑Ｐｒｉｍｅｒｓ逦Ｐｒｉｍｅｒｓ逡逑Ｂ逡逑＿邋０４１逦■邋ＰＰＲＥ逡逑＾逦Ｔ逦Ｅ３邋Ｉｎｔｒｏｎｉ逡逑！邋°－３＇邋Ｉ逡逑『■W逡逑Ｏｌ逦W逦＊逡逑ｔｏ逦ｍ逦ｉ￣ｉ逡逑０．０」悘——ｇａ，和逡逑图１－３邋ＰＰＡＲｙ与启动子区存在特异结合逡逑（Ａ）邋７ＶＯ以／基因启动子区到第一个内含子区示意图，绿色长方形代表第一个外显子，橙色长逡逑方形代表ＰＰＲＥ，黑色长线段代表内启动子区和内核子区，黑色箭头代表引物扩增的区域；（Ｂ）逡逑在成脂诱导４８ｈ的ＡＤＳＣｓ交联处理好，使用ＰＰＡＲｙ邋ｍＡｂ或ＩｇＧ进行ＣｈＩＰ实验，ｑＰＣＲ检测逡逑ＰＰＡＲｙ在基因组不同区域的富集；将Ｉｎｐｕｔ的信号作为１，计算每组样品的相对值；数值用均值逡逑士标准差（ｍｅａｎ土ＳＤ）表不

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