白念珠菌Sac1蛋白的鉴定及其功能的研究

发布时间：2020-09-27 21:48

　　白念珠菌是临床上最为重要的条件性致病真菌之一。由于免疫缺陷人群的不断增加,白念珠菌引起的感染备受关注。在与宿主相互作用的过程中,白念珠菌进化出极为精细的形态发生及压力应答系统,能够有效定殖并抵御宿主免疫系统攻击。磷脂酰肌醇衍生物是真核细胞极为重要的一类小分子物质,与细胞的信号转导、生长代谢调节紧密相关。在酿酒酵母及许多哺乳动物细胞中,磷脂酰肌醇磷酸酶Sac1及其同源蛋白介导了磷脂酰肌醇一磷酸或磷脂酰肌醇二磷酸向磷脂酰肌醇的转化,在肌动蛋白组装、细胞极性确立、细胞壁功能维持、胞吞与胞吐等过程中扮演重要角色。然而,白念珠菌的Sacl蛋白及其功能至今尚未明确。本研究即对白念珠菌的Sacl蛋白进行分子鉴定及功能分析。主要结果如下：(1)通过BLASTP分析,从白念珠菌基因组数据库中鉴定出一种与酿酒酵母ScSac1同源的蛋白,命名为Sacl。序列比对分析发现,该蛋白属于SAC家族成员,具有保守的CX5R(T/S)基序及SAC结构域。通过构建白念珠菌SAC1基因在酿酒酵母中的回补菌株,发现该基因能够回补酿酒酵母ScSAC1缺失造成的肌醇营养缺陷,提示白念珠菌Sacl蛋白参与了磷脂酰肌醇代谢。通过GFP定位技术,发现Sac1蛋白主要定位于内质网膜,提示该蛋白与内质网功能紧密相关。(2)采用两步PCR介导的同源重组法,构建白念珠菌SAC1基因的缺失菌株,在此基础上构建回补菌株。采用固体点板实验,发现SAC1基因的缺失造成白念珠菌对内质网压力及细胞壁压力药物高度敏感；酸性磷酸酶分析实验表明,SAC1基因的缺失导致白念珠菌的糖基化能力发生缺陷；几丁质染色及透射电镜观察结果显示,该基因缺失导致细胞壁几丁质分布与含量发生改变,以及细胞壁超显微结构异常；采用GFP报告系统及实时定量PCR技术,发现该基因的缺失导致非折叠蛋白应答(UPR)基因及细胞壁完整性(CWI)基因表达的上调。上述结果表明Sac1蛋白在内质网及细胞壁完整性维持方面发挥重要作用。(3)SAC1基因缺失导致白念珠菌菌丝发育能力降低,细胞仅能形成弯曲的菌丝,提示sac1Δ/Δ缺失株菌丝的极性生长能力受阻。肌动蛋白染色及Hwp1定位分析表明,SAC1基因缺失导致肌动蛋白斑在菌丝顶端的定位发生紊乱,以及菌丝特异性蛋白的极性转运过程存在缺陷,表明Sacl通过维持肌动蛋白骨架的顶端定位,调控菌丝特异性蛋白的极性转运过程。(4)SAC1基因缺失导致白念珠菌侵染宿主上皮细胞及耐受巨噬细胞攻击的能力显著下降,并且丧失了系统性感染小鼠的能力,表明Sac1与白念珠菌的毒力紧密相关,是一种重要的毒力相关因子
【学位单位】：南开大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R379.4
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章前言
    第一节白念珠菌的基本特性及致病性
    第二节白念珠菌的形态发生
    第三节白念珠菌的极性生长过程
        1.3.1 极性生长的概念及生物模型
        1.3.2 极性生长的调控
        1.3.3 白念珠菌极性生长的研究现状
    第四节磷脂酰肌醇磷酸酶Sac1的研究进展
        1.4.1 磷脂酰肌醇磷酸代谢网络的概述
        1.4.2 磷脂酰肌醇磷酸酶Sac1的生物学功能
        1.4.3 酿酒酵母Sac1的研究进展
    第五节选题依据及技术路线
        1.5.1 选题依据
        1.5.2 本研究的技术路线
第二章材料与方法
    第一节实验材料
        2.1.1 实验菌株
        2.1.2 质粒
        2.1.3 引物
        2.1.4 实验仪器
        2.1.5 实验试剂
        2.1.6 培养基
        2.1.7 主要溶液
    第二节实验方法
        2.2.1 白念珠菌/酿酒酵母菌株的活化
        2.2.2 白念珠菌的转化(醋酸锂转化法)
        2.2.3 酿酒酵母的转化(醋酸锂转化法)
        2.2.4 白念珠菌/酿酒酵母基因组的提取
        2.2.5 白念珠菌SAC1基因的敲除
        2.2.6 PCR反应体系及程序
        2.2.7 酶切体系
        2.2.8 DNA连接体系
        2.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备
        2.2.10 大肠杆菌的转化
        2.2.11 大肠杆菌质粒的提取(碱裂解法)
        2.2.12 白念珠菌RNA的提取及纯化、cDNA的获得
        2.2.13 实时定量PCR(RT-PCR)
        2.2.14 白念珠菌总蛋白的提取(液氮研磨法)
        2.2.15 蛋白浓度的测定(考马斯亮蓝法)
        2.2.16 分泌型酸性磷酸酶(SAPs)糖基化水平的测定
        2.2.17 白念珠菌的菌丝诱导
        2.2.18 白念珠菌粘附能力的测定(聚苯乙烯孔板法)
        2.2.19 白念珠菌生物被膜形成能力测定
        2.2.20 白念珠菌压力敏感性的测定(稀释点板法)
        2.2.21 白念珠菌肌动蛋白细胞骨架的染色观察
        2.2.22 白念珠菌细胞壁压力敏感性的测定(物理振荡压力)
        2.2.23 白念珠菌细胞壁几丁质染色观察及几丁质含量测定
        2.2.24 白念珠菌侵染上皮细胞能力的测定
        2.2.25 白念珠菌与巨噬细胞相互作用能力的测定
        2.2.26 小鼠系统性感染能力测定
第三章结果与分析
    第一节白念珠菌Sac1蛋白的鉴定
        3.1.1 白念珠菌Sac1蛋白序列及三维结构分析
        3.1.2 白念珠菌SAC1基因缺失及回补菌株的构建
        3.1.3 白念珠菌Sac1在酿酒酵母中功能的研究
        3.1.4 白念珠菌Sac1定位研究
    第二节 SAC1基因的缺失对内质网功能的影响
        3.2.1 SAC1基因的缺失会增加白念珠菌细胞的内质网压力敏感性
        3.2.2 SAC1基因的缺失对糖基化功能的影响
        3.2.3 SAC1基因的缺失导致细胞UPR途径的激活
    第三节 SAC1基因的缺失对细胞壁完整性的影响
        3.3.1 SAC1基因的缺失对细胞壁压力敏感性的影响
        3.3.2 SAC1基因缺失对细胞壁几丁质分布及含量的影响
        3.3.3 SAC1基因缺失对细胞壁超显微结构的影响
        3.3.4 SAC1基因的缺失对基因表达的影响
    第四节 SAC1基因的缺失对形态发生的影响
        3.4.1 SAC1基因的缺失对菌丝发育能力的影响
        3.4.2 SAC1基因的缺失对体外模拟与宿主相互作用能力的影响
        3.4.3 SAC1基因的缺失会造成极性相关成分定位的变化
    第五节 Sac1在白念珠菌与宿主细胞相互作用中的功能
        3.5.1 SAC1基因的缺失对白念珠菌与巨噬细胞相互作用能力的影响
        3.5.2 SAC1基因缺失对白念珠菌侵染肠道上皮细胞能力的影响
        3.5.3 SAC1基因的缺失对白念珠菌系统性感染小鼠能力的影响
第四章讨论
    第一节白念珠菌Sac1的序列与功能分析
    第二节 Sac1与白念珠菌内质网功能维持的关系
    第三节 Sac1与白念珠菌细胞壁完整性的关系
    第四节 Sac1与白念珠菌的极性生长
    第五节 Sac1与白念珠菌的致病性
第五章结论与展望
    第一节结论
    第二节论文的主要特色与创新点
    第三节展望
参考文献
致谢
个人简历及在学期间发表的学术论文

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