目的:精原干细胞(Spermatogonial stem cells,精原干细胞)既可分化为成熟精子细胞,也可自我更新保持干细胞数量的稳定,对男性生育力维持有重要的作用。精原干细胞是人体内唯一可以将遗传物质传递给子代的成体干细胞,在生殖医学和再生医学有重要的应用前景。由于环境因素、不良生活方式、感染、遗传因素等交互影响,不育症已成为严重影响人类生殖与人口健康的重大疾病。在世界范围内,不孕不育约占育龄夫妇的15%,其中,由男性因素引起的不育症约占一半。非梗阻性无精子症无有效的治疗方法,其发病机制不清楚。据报道,人精原干细胞在非梗阻性无精子症(NOA)患者比梗阻性无精子症(OA)人群数目显著减少,且体外培养过程中NOA患者的精原干细胞增殖减慢,表明人精原干细胞增殖、凋亡的异常参与非梗阻性无精子症的致病机制。由于人类精原干细胞的来源有限,原代精原干细胞体外长期培养困难,人类精原干细胞自我更新调控的分子机制未见报道。因此,我们首次发现了人精原干细胞中PAK1在生长因子刺激下表达升高,并研究了PAK1在人精原干细胞的表达及其对人精原干细胞自我更新与凋亡的作用及其调控的分子机制。并且,我们比较了NOA和OA人群中的表达水平。本学位论文将为人类精原干细胞的命运决定提供新的遗传与表观遗传调控机制。方法:通过RT-PCR、Western blots、免疫细胞化学等技术对人精原干细胞系进行鉴定和纯度检测。免疫细胞化学和免疫组织化学检测PAK1在人精原干细胞系和人类生精小管的表达。生长因子处理后,我们运用real-time PCR和Western blots检测了PAK1的表达;为了确定调控PAK1表达变化的生长因子,我们培养基中添加了生长因子浓度为10 ng/ml GDNF、10 ng/ml FGF2或者10 ng/ml EGF、以及联合三种生长因子,并进行PAK1表达水平的检测。PAK1-si RNAs转染后,在RNA和蛋白水平确认敲低效果后,进行CCK8、PCNA水平、Brd U摄入、流式细胞凋亡等实验,检测PAK1对人精原干细胞系的增殖和凋亡的影响。裸鼠腹腔注射白消安,去除其睾丸组织内的生殖细胞后,进行人精原干细胞系的移植实验。移植一个月后,裸鼠睾丸组织切片,并进行PLZF、PCNA、Ki67、UCHL1等蛋白的免疫组织化学染色和TUNEL染色,在动物体内和整体水平研究PAK1对精原干细胞系的影响。Western blots检测PAK1调控人类精原干细胞的ERK1/2和AKT信号通路的改变和细胞周期蛋白的变化。免疫共沉淀检测PAK1和PDK1的相互作用。RNA-seq寻找PAK1的下游靶基因,通过生物信息学分析结合real-time PCR验证,选取具有重要生物学意义的下游基因。通过CCK8和流式细胞技术等检测PAK1的靶基因调控人精原干细胞系的生物学功能。mi RNA芯片检测PAK1敲低后非编码小RNA(mi RNA)的变化,研究PAK1调控人精原干细胞的表观遗传学机制。此外,real-time PCR、Western blots和组织芯片对NOA和OA人群中PAK1的m RNA和蛋白表达水平进行比较。本学位论文采用Graph Pad prism5.0进行数据分析,两组之间的分析采用t检验,多组数据之间的分析采用单因素方差分析(ANOVA),p0.05认为有统计学差异显著。结果:RT-PCR、Western blots、免疫细胞化学结果显示,人精原干细胞系表达原代人精原干细胞的多种分子标记。生长因子EGF作用下,PAK1的表达水平升高,而GDNF或FGF2不改变PAK1的表达水平。PAK1敲低后,CCK8、PCNA检测、Brd U摄入和流式细胞等实验表明,PAK1可以促进人类精原干细胞系DNA合成和增殖,抑制其凋亡。人精原干细胞系移植实验显示,在体内和整体水平,PAK1可以促进精原干细胞系增殖,抑制其凋亡发生率。RNA测序表明,PAK1敲低后,与细胞增殖密切相关的PDK1、ZNF367和KDR的表达水平显著降低。免疫共沉淀结果表明PAK1可以与PDK1相互作用;ZNF367敲低后,PDK1和KDR m RNA表达水平发生降低。PDK1-,KDR-和ZNF367-si RNAs转染后,人精原干细胞系增殖受到抑制,细胞凋亡发生率增加;另外,PAK1敲低后,我们发现phos-ERK1/2,phos-AKT和cyclin A的蛋白水平降低。芯片检测,PAK1敲低后,人精原干细胞系mi RNA表达的变化,发现mi R-31-5p显著升高,生物信息学预测其靶标,并经过mi R-31-5p mimics和inhibitor结合q PCR验证,结果表明JAZF是其主要靶标。Real-time PCR、Western blots和组织芯片结果表明,与梗阻性无精子在症人群相比,PAK1的m RNA和蛋白表达水平在非梗阻性无精子在症人群中表达降低。结论:人精原干细胞系表达原代人精原干细胞多个分子标记,该细胞系纯度好,可以用于人精原干细胞自我更新与凋亡的分子调控研究。我们发现,PAK1主要受EGF调控,而不受GDNF或FGF2的影响。PAK1可以体外促进人精原干细胞系DNA合成和增殖,抑制其凋亡。PAK1可体内促进人精原干细胞系在白消安处理后的小鼠的生精子小管内定居、增殖,并抑制其发生凋亡。PAK1主要通过ERK1/2和AKT通路影响PDK1/KDR/ZNF367等下游基因而发挥功能,PAK1调控人精原干细胞系mi R-31-5p的表达。本学位论文揭示了PAK1在人精原干细胞系增殖与凋亡的作用与分子机制,及其在NOA患者中的异常表达,为男性不育的发生机制和人精原干细胞在转化医学中的应用提供新的遗传与表观遗传调控机制。
【学位单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R321.1
【部分图文】：
54图 4. PAK1 敲低后人精原干细胞系在异体移植裸鼠中存活减少、增殖减慢、凋亡比例增加。(A-F)免疫组织化学分析 PAK1 敲低后人精原干细胞系移植的裸鼠睾丸组织中 UCHL1、PLZF、PCNA、Ki67 和 TUNEL 表达。A-E 中标尺为 10 μm。 *表示与对照 siRNA 组比有统计学差异(p<0.05)。
上海交通大学博士学位论文差异表达基因，包括 PDK1、KDR、ZNF367、GPX3、OIP5、THAP10、DBP 和TET1，在 PAK1 敲低后其表达水平下调(图 5-E)，该结果与 RNA 测序结果(表 7)相一致，证明 RNA 测序结果准确可信。
上海交通大学博士学位论文THAP10 THAP domain containing 10 0.335 0.001493DBP albumin D-box binding protein 0.424 0.001132TET1 tet methylcytosine dioxygenase 1 0.5 0.000088
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 罗玥佶;曾杰;汤瑞玲;王行明;范立青;;精原干细胞的生物学特性:现状、发展与应用[J];长沙医学院学报;2018年02期
2 孙兆林;胡建新;何坚;梁韶峰;张勇;袁军;;温度对小鼠精原干细胞消化作用的影响[J];中国男科学杂志;2009年03期
3 孙擎;刘厚奇;;精原干细胞研究进展[J];解剖学杂志;2009年01期
4 张德迎;何大维;魏光辉;宋晓峰;李旭良;林涛;;精原干细胞在支持细胞饲养层上的长期培养(英文)[J];四川大学学报(医学版);2008年01期
5 王庆忠;石玉强;刘慧莲;;小鼠精原干细胞的分离、分选、移植和培养[J];潍坊学院学报;2007年02期
6 余荣娇;徐斯凡;;大鼠A型精原干细胞的分离和纯化[J];安徽医学;2007年03期
7 ;日研究人员利用虹鳟鱼精原干细胞培育卵子[J];养殖与饲料;2006年03期
8 孙思宇;李碧春;;精原干细胞体外培养的研究进展[J];黑龙江畜牧兽医;2006年06期
9 王萍,吴绍华,何红媛,王琼,吴丽君;兔精原干细胞培养及生物学特征的初步研究[J];泸州医学院学报;2005年01期
10 辛颖;张志强;安宁;张涛;张建峰;张智英;;小鼠精原干细胞不同转染方法效率的比较[J];中国生物化学与分子生物学报;2014年01期
相关博士学位论文 前10条
1 付红勇;PAK1对人类精原干细胞自我更新与凋亡的调控作用及其分子机制研究[D];上海交通大学;2018年
2 魏超;FOXC2在小鼠精原干细胞中表达和功能的研究[D];中国农业大学;2018年
3 况玲;猪胚胎干细胞的分离、培养、鉴定和分化的研究[D];甘肃农业大学;2004年
4 张学明;小鼠精原干细胞培养体系的优化及体外基因转移[D];吉林大学;2005年
5 王庆忠;小鼠精原干细胞的富集、移植与培养及GDNF在精子发生中作用机制[D];山东师范大学;2006年
6 李恩中;精原干细胞的体外培养及自增殖相关因子的筛选与初步研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2007年
7 张世庆;精原干细胞自增殖分子机制研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2007年
8 阿拉达尔;山羊精原干细胞体外培养体系的建立与移植研究[D];西北农林科技大学;2007年
9 张晓明;海鞘（Ciona savignyi）性腺组织细胞、血细胞和生殖干样细胞的体外培养[D];中国科学院研究生院（海洋研究所）;2008年
10 贺鑫;棉酚诱导山羊精原干细胞凋亡的分子机理研究[D];西北农林科技大学;2017年
相关硕士学位论文 前10条
1 李恬娇;纳米材料G5-cRGD负载siRNA转染精原干细胞技术体系的建立[D];西北农林科技大学;2019年
2 李江;miR-10b与靶基因KLF4相互作用调节精原干细胞的自我更新[D];宁夏医科大学;2017年
3 张晓娜;小鼠精原干细胞分离、纯化与去分化研究[D];内蒙古大学;2019年
4 谢慧;体外培养条件下双酚A诱导精原干细胞凋亡及其所致转录组变化[D];上海交通大学;2017年
5 郭柯君;自噬在六价铬致大鼠睾丸及精原干细胞损伤中作用的研究[D];吉林大学;2019年
6 张国栋;原始生殖细胞的体外特化和猴睾丸精原干细胞的鉴定[D];昆明理工大学;2018年
7 张莹;猪精原干细胞培养体系优化与异种移植特性检测[D];西北农林科技大学;2018年
8 李浩;Epiregulin、Epigen和SCF对山羊精原干细胞体外增殖调控的研究[D];西北农林科技大学;2018年
9 陈秋宇;几种体外添加物对罗非鱼精原干细胞增殖和抗氧化能力的影响[D];广东海洋大学;2015年
10 崔艳华;褪黑素通过抑制内质网应激缓解小鼠睾丸损伤和精原干细胞凋亡[D];西北农林科技大学;2018年
本文编号：
2839124
