目的:本课题前期研究证实干扰素-α(Interferon-α,IFN-α)能够促进口蹄疫重组腺病毒疫苗诱导滤泡辅助性T细胞(Follicular helper T cell,Tfh)的分化和促进生发中心的形成,从而增强小鼠的体液免疫应答。研究证实,CD4~+T细胞中存在长寿命记忆性Tfh细胞并主要负责激活IgG1型记忆B细胞,启动适应性免疫应答。但IFN-α是否能促进记忆性Tfh细胞的产生尚不清楚。因此,本研究通过体内实验明确IFN-α对FMD重组腺病毒疫苗诱导记忆性Tfh细胞分化及其功能的影响,初步探讨IFN-α促进FMD重组腺病毒疫苗诱导记忆性Tfh细胞分化的机制,为进一步研究IFN-α调控疫苗免疫的新机制提供理论数据。方法:1.将6-8周雌性BALB/c小鼠随机分为6组,每组20只,分别免疫腺病毒空载体(rAd)、表达FMDV VP1的重组腺病毒(rAd5VP1)、表达猪IFN-α的重组腺病毒(rAd5poIFN-α)、共表达FMDV VP1和猪IFN-α的重组腺病毒(rAd5VP1-2A-poIFN-α)、联合免疫rAd5VP1和rAd5poIFN-α(rAd5VP1+rAd5poIFN-α)以及猪O型口蹄疫灭活疫苗(inactivited vaccine);间隔两周免疫一次,共免疫2次。分别在初次免疫后30天、60天、90天取小鼠脾脏,密度梯度离心法收获单个核细胞,采用流式细胞术检测CD4~+CD44~+活化T细胞、CD4~+CD44~+CD62L~-记忆性T细胞、CD4~+CXCR5~+记忆性Tfh细胞的比例;流式细胞术检测CD38~+B220~+记忆性B细胞、CD38~+B220~+GL-7~-IgG1~+记忆性B细胞的比例。在初次免疫后90天流式细胞术检测Tfh细胞中趋化因子CXCR3、CCR6的表达。2.初次免疫90天后,对小鼠进行再次免疫,免疫前及免疫后3天做如下研究:2.1取小鼠脾脏,密度梯度离心法收获单个核细胞,采用流式细胞术检测CD4~+CD44~+活化T细胞、CD4~+CD44~+CD62L~-记忆性T细胞、CD4~+CXCR5~+记忆性Tfh细胞的比例;Tfh细胞特征性转录因子Bcl-6的表达;Tfh细胞分泌细胞因子IL-21、IL-4、IFN-γ的表达水平;记忆性B细胞中协同共刺激分子CD86的表达水平。2.2取小鼠脾脏,密度梯度离心法收获单个核细胞,采用real-time PCR技术检测Tfh细胞相关转录因子STAT1、Bcl-6的表达水平。2.3取小鼠眼球血,分离血清,采用ELISA检测total IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b的分泌水平。结果:1.IFN-a促进口蹄疫重组腺病毒疫苗诱导记忆性T细胞、记忆性Tfh细胞的产生。1.1小鼠免疫重组腺病毒30天后,流式细胞术检测结果显示:rAd5VP1+rAd5poIFN-α组和rAd5VP1-2A-poIFN-α组CD4~+CD44~+细胞的比例明显高于rAd组,差异有统计学意义;rAd5VP1-2A-poIFN-α组CD4~+CD44~+细胞的比例明显高于rAd5VP1组,差异有统计学意义;CD4~+CD44~+细胞数量在60天持续存在,90天之后略有下降。1.2小鼠免疫重组腺病毒30天后,rAd5VP1+rAd5poIFN-α组和rAd5VP1-2A-poIFN-α组CD4~+CD44~+CD62L~-细胞的比例明显高于rAd组,差异有统计学意义;CD4~+CD44~+CD62L~-细胞数量在在60天持续存在,90天之后略有下降。1.3小鼠免疫重组腺病毒30天后,rAd5VP1+rAd5poIFN-α组和rAd5VP1-2A-poIFN-α组CD4~+CXCR5~+细胞的比例明显高于rAd组、rAd5VP1组以及rAd5poIFN-α组,差异有统计学意义;rAd5VP1-2A-poIFN-α组CD4~+CXCR5~+细胞的比例明显高于inactivited vaccine组,差异有统计学意义;CD4~+CXCR5~+细胞数量在在60天持续存在,90天之后略有下降。1.4小鼠免疫重组腺病毒90天后,流式细胞术检测结果显示:rAd5VP1-2A-poIFN-α组Th1型Tfh细胞(CXCR3~+CCR6~-)的比例明显高于rAd组、rAd5VP1组、rAd5poIFN-α组以及inactivited vaccine组,差异有统计学意义;rAd5VP1+rAd5poIFN-α组Th1型Tfh细胞(CXCR3~+CCR6~-)的比例明显高rAd组,差异有统计学意义。rAd5VP1+rAd5poIFN-α组Th2型Tfh细胞(CXCR3~-CCR6~-)的比例明显高于rAd组、rAd5VP1组以及rAd5poIFN-α组,差异有统计学意义;rAd5VP1-2A-poIFN-α组Th2型Tfh细胞(CXCR3~-CCR6~-)的比例明显高于rAd组和rAd5poIFN-α组,差异有统计学意义;各组间Th17型Tfh细胞(CXCR3~-CCR6~+)数量无明显差异。2.IFN-a促进口蹄疫重组腺病毒疫苗诱导记忆性B细胞的分化2.1小鼠免疫重组腺病毒30天后,流式细胞术检测结果显示:rAd5VP1+rAd5poIFN-α组、rAd5VP1-2A-poIFN-α组和inactivited vaccine组CD38~+B220~+细胞的比例明显高于rAd组和rAd5poIFN-α组,差异有统计学意义;rAd5VP1组CD38~+B220~+细胞的比例明显高于rAd组,差异有统计学意义;CD38~+B220~+细胞数量在60天持续存在,90天之后略有下降。2.2小鼠免疫重组腺病毒30天后,rAd5VP1-2A-poIFN-α组CD38~+B220~+GL-7~-IgG1~+细胞的比例明显高于rAd组、rAd5VP1组和rAd5poIFN-α组,差异有统计学意义;rAd5VP1+rAd5poIFN-α组CD38~+B220~+GL-7~-IgG1~+细胞的比例明显高于rAd5VP1组,差异有统计学意义;CD38~+B220~+GL-7~-IgG1~+细胞数量在60天持续存在,90天之后略有下降。3.小鼠再次免疫重组腺病毒对记忆性Tfh细胞以及体液免疫应答的影响3.1小鼠首次免疫后90天再次免疫重组腺病毒,3天后,流式细胞术检测结果显示:各组CD4~+CD44~+细胞、CD4~+CD44~+CD62L~-细胞以及CD4~+CXCR5~+细胞的比例明显高于再免疫前,差异有统计学意义。3.2小鼠首次免疫后90天再次免疫重组腺病毒,3天后,流式细胞术检测结果显示:rAd5VP1组、rAd5VP1+rAd5poIFN-α组、rAd5VP1-2A-poIFN-α组和inactivited vaccine组Tfh细胞中IL-21的表达明显高于再免疫前,差异有统计学意义;其余各组有升高趋势,但无统计学差异。rAd5poIFN-α组、rAd5VP1+rAd5poIFN-α组和rAd5VP1-2A-poIFN-α组Tfh细胞中IFN-γ的表达明显高于再免疫前,差异有统计学意义;其余各组有升高趋势,但无统计学差异。各组Tfh细胞中IL-4的表达明显高于再免疫前,差异有统计学意义。3.3小鼠首次免疫后90天再次免疫重组腺病毒,3天后,流式细胞术检测结果显示:rAd5VP1+rAd5poIFN-α组、rAd5VP1-2A-poIFN-α组记忆性B细胞表面协同共刺激分子CD86的表达明显高于再免疫前,差异有统计学意义;其余各组有升高趋势,但无统计学差异。3.4小鼠首次免疫后90天再次免疫重组腺病毒,3天后,ELISA结果显示:各组血清中total IgG、IgG1抗体的分泌水平明显高于再免疫前,差异有统计学意义;inactivited vaccine组血清中IgG2a抗体的分泌水平明显高于再免疫前,差异有统计学意义;其余各组无统计学差异。rAd5VP1+rAd5poIFN-α组、rAd5VP1-2A-poIFN-α组和inactivited vaccine组血清中IgG2b抗体的分泌水平明显高于再免疫前,差异有统计学意义;其余各组无统计学差异。4.IFN-a促进口蹄疫重组腺病毒疫苗诱导转录因子Bcl-6、STAT1的表达。4.1小鼠免疫重组腺病毒90天后,流式细胞术检测结果显示:各组CXCR5~+T细胞中转录因子Bcl-6的表达均明显高于CXCR5~-T细胞,差异有统计学意义。4.2小鼠首次免疫后90天再次免疫重组腺病毒,3天后,流式细胞术检测结果显示:rAd组、rAd5VP1组、rAd5poIFN-α组、rAd5VP1+rAd5poIFN-α组以及rAd5VP1-2A-poIFN-α组Tfh细胞(CXCR5~+Bcl-6~+)数量比例明显高于再免疫前,差异有统计学意义;inactivited vaccine组Tfh细胞(CXCR5~+Bcl-6~+)数量比例有升高趋势,但无统计学差异。4.3小鼠首次免疫后90天再次免疫重组腺病毒,3天后,real-time PCR检测结果显示:各组STAT1 mRNA的表达水平明显高于再免疫前,差异有统计学意义;rAd组、rAd5VP1组、rAd5poIFN-α组、rAd5VP1+rAd5poIFN-α组以及rAd5VP1-2A-poIFN-α组Bcl-6 mRNA的表达水平明显高于再免疫前,差异有统计学意义;inactivited vaccine组Bcl-6 mRNA的表达水平相比于再免疫前有升高趋势,但无统计学差异。结论:IFN-α作为口蹄疫重组腺病毒疫苗的免疫调节剂,能够增强重组腺病毒疫苗诱导记忆性T细胞、记忆性Tfh细胞、记忆性B细胞的分化,增强Tfh细胞趋化因子(CXCR3,CCR6)的表达;促进细胞因子(IL-21,IL-4,IFN-γ)及抗体的分泌;再次免疫后,IFN-α促进口蹄疫重组腺病毒疫苗诱导的Tfh细胞发挥免疫功能,IFN-α可能通过提高转录因子STAT1的表达促进Bcl-6的表达,进而促进Tfh细胞的分化。为进一步研究IFN-α调控疫苗免疫的新机制提供理论数据。
【学位单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R392
【部分图文】：
宁夏医科大学硕士学位论文 结果图 1. 活化 T 细胞、记忆性 T 细胞、记忆性 Tfh 细胞的设门策略10.2 FCM 检测小鼠免疫后 30 天、60 天、90 天活化 T 细胞的数量FCM 结果显示如图 2 ， rAd5VP1+rAd5poIFN-α 组和 rAd5VP1-2A-poIFN-α 组CD4+CD44+细胞的比例分别为 2.85%±0.14% 和 2.98%±0.33%，明显高于 rAd 组（2.46%±0.32%），P<0.05，差异有统计学意义；rAd5VP1-2A-poIFN-α 组 CD4+CD44+细胞的比例明显高于 rAd5VP1 组（2.53%±0.33%），P<0.05，差异有统计学意义；rAd5VP1+rAd5poIFN-α 组和 rAd5VP1-2A-poIFN-α 组较其余各组有升高趋势，但无统计学差异。活化 T 细胞（CD4+CD44+）数量持续存在至少 90 天以上。
宁夏医科大学硕士学位论文 结果CD4+CD44+CD62L-细胞的比例为 10.13%±0.99%，明显高于 rAd 组，P<0.01，差异有统计学意义；rAd5VP1+rAd5poIFN-α 组、Ad5VP1-2A-poIFN-α 组和 inactivited vaccine 组较其余各组有升高趋势，但无统计学差异。记忆性 T 细胞（CD4+CD44+CD62L-）数量持续存在至少 90 天以上。
图 4. FCM 检测小鼠免疫后 30 天、60 天、90 天记忆 Tfh 性细胞的数量11. FCM 检测再免疫前后活化 T 细胞、记忆性 T 细胞、记忆性 Tfh 细胞数量6-8 周雌性 BALB/c 小鼠随机分为 6 组，分别免疫 rAd、rAd5VP1、rAd5poIFN-α、rAd5VP1-2A-poIFN-α、rAd5VP1+rAd5poIFN-α 以及 inactivited vaccine；间隔两周免疫一次，共免疫 2 次。初次免疫后 90 天，分别以相同重组腺病毒再次免疫，3 天后，取小鼠脾脏，密度梯度离心法收获单个核细胞，采用 FCM 检测免疫前后 CD4+CD44+活化 T 细胞、CD4+CD44+CD62L-记忆性 T 细胞以及 CD4+CXCR5+记忆性 Tfh 细胞的数量。FCM 结果显示如图 5 ，各组 CD4+CD44+细胞、CD4+CD44+CD62L-细胞以及CD4+CXCR5+细胞的比例明显高于再免疫前，差异有统计学意义。
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本文编号：
2840534
