短链脂肪酸对秀丽隐杆线虫寿命的影响及分子机制的初步探究

发布时间：2020-10-16 01:16

　　 短链脂肪酸主要来源于生物体内肠道菌群代谢,有着重要的生物学作用。在作为生物体内能源物质的同时,还具有抗炎、影响肠道菌群代谢和预防早发I型糖尿病等重要作用。目前多数研究围绕传统脂肪酸而展开,但相关生物学作用还不够完善,作用机理不够清楚。此外,对取代短链脂肪酸的相关研究尚未见报道。本研究通过采用秀丽隐杆线虫作为实验的模式动物,胡桃醌为氧化剂构建氧化应激模型,发现了具有体内抗氧化生物活性的取代短链脂肪酸,并进一步研究了2′-甲基丁酸对线虫衰老的影响及其分子机制。(1)短链脂肪酸抗氧化生物活性筛选本文以胡桃醌为氧化剂,秀丽隐杆线虫为模式动物构建体内抗氧化应激模型,并以此模型检测传统短链脂肪酸和取代短链脂肪酸体内抗氧化生物活性。传统短链脂肪酸氧化应激实验表明,甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和戊酸不具有体内抗氧化活性,不能延长线虫氧化应激条件下的存活时间。实验进一步检测了取代短链脂肪酸对线虫抗氧化应激能力的影响。甲基取代的短链脂肪酸氧化应激实验结果表明,2′-甲基丁酸(n=4)、2′-甲基戊酸(n=5)和2′-甲基己酸(n=6)能够显著延长线虫氧化应激条件下的存活时间,具有体内抗氧化生物活性,2′-甲基丙酸(n=3)和3′-甲基丁酸(n=4)对线虫氧化应激条件下存活时间无明显影响,不具有体内抗氧化生物活性,取代短链脂肪酸的抗氧化生物活性与取代短链脂肪酸的主链碳原子数和取代烷烃的位置有关。为了进一步研究乙基取代短链脂肪酸的抗氧化生物活性,通过氧化应激实验证实2′-乙基丁酸和2′-乙基己酸不具有体内抗氧化生物活性,取代短链脂肪酸的抗氧化生物活性与取代烷烃的长度有关。综上表明,传统短链脂肪酸不具有体内抗氧化生物学活性,2′-甲基取代短链脂肪酸(n=4–6)具有体内抗氧化生物活性,其体内抗氧化生物活性具有特异性,主链碳原子数、取代烷烃的位置和长度对取代短链脂肪酸的抗氧化作用至关重要。(2)2′-甲基丁酸抗氧化作用机理研究以半胱氨酸为阳性对照,通过DPPH和ABTS两种方法检测了2′-甲基丁酸体外直接清除自由基的能力。实验结果表明2′-甲基丁酸不具有体外直接清除自由基的能力。通过2′,7′二氯氢化荧光素乙二脂染料对线虫体内的活性氧自由基染色,发现2′-甲基丁酸处理后的线虫的荧光强度显著低于对照组,表明2′-甲基丁酸能够降低线虫体内活性氧自由基的水平。通过高温和抗生素两种方式对线虫喂食的大肠杆菌进行灭活实验,进一步检测菌代谢对2′-甲基丁酸体内抗氧化生物活性的影响,两种方式处理的大肠杆菌不影响2′-甲基丁酸的抗氧化生物活性。体外自由基清除实验及死菌氧化应激实验的结果证明,2′-甲基丁酸的抗氧化生物活性不依赖于体外对自由基的清除和菌代谢。通过氧化应激实验进一步检测了2ˊ-甲基丁酸对基因突变线虫抗氧化活性的影响,并确定了其活性所依赖的信号通路。实验发现,2ˊ-甲基丁酸不能增强生殖腺信号通路突变线虫glp-1的抗氧化应激能力,能够增强胰岛素信号通路突变体daf-2线虫、线粒体信号通路突变体clk-1线虫和饮食限制信号通路突变体线虫eat-2的抗氧化应激能力,实验结果进一步证实2ˊ-甲基丁酸作用于生殖腺信号通路。为了进一步研究2ˊ-甲基丁酸抗氧化作用机理,通过q-PCR和转基因GFP线虫实验检测2ˊ-甲基丁酸对daf-16、sod-3和gst-4等经典抗氧化基因表达的影响。实验结果表明2ˊ-甲基丁酸能够上调gst-4表达,增强相关转基因线虫GFP荧光强度,进一步证明了2ˊ-甲基丁酸作用于生殖腺信号通路,通过上调抗氧化基因gst-4的表达增强线虫抗氧化应激能力。(3)2′-甲基丁酸对线虫衰老的影响寿命是评价线虫衰老的最主要的指标。除此之外,线虫的衰老将伴随着生殖能力、运动能力和对外界抗性的下降。本文通过线虫的衰老指标评价2ˊ-甲基丁酸对线虫衰老的影响。在线虫生殖能力方面,实验观察并统计了线虫产卵周期和产卵数目,发现2′-甲基丁酸能够延长线虫的产卵周期,增加线虫的产卵数目。在线虫运动能力方面,实验统计了线虫吞咽泵的吞咽频率和线虫头部摆动次数,实验结果证明2′-甲基丁酸能够增加线虫吞咽泵吞咽频率和线虫头部摆动次数。在线虫对外界抗性方面,通过紫外和高温应激实验进一步检测了2′-甲基丁酸对线虫紫外辐射和高温应激能力的影响,发现2′-甲基丁酸能够增强线虫对紫外和高温的应激能力。在线虫寿命方面,实验检测了2′-甲基丁酸对野生型线虫N2和生殖腺信号通路突变体glp-1的寿命的影响,发现2′-甲基丁酸能够显著延长野生型线虫N2的寿命,但对突变体线虫glp-1的寿命无影响,实验结果进一步证明2′-甲基丁酸对生殖腺信号通路的作用和影响。
【学位单位】：长春理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R383.1
【部分图文】：

氧化应激模型的构建及短链脂肪酸实验浓度的确定：(a)200μM胡桃醌氧化应激模型构建流程图；(b)clk-1(mq130)，daf-2(e1368)突变体线虫氧化应激条件下生存曲线；(c)不同浓度的2ˊ-

21 - 2 传统短链脂肪酸氧化应激实验：(a) 甲酸氧化应激实验，P =0.1269；(b) 乙酸氧化激试.221；(c) 丙酸氧化应激实验，P = 0.5852；(d) 丁酸氧化应激实验，P< 0.0001；(e) 戊酸实验，P< 0.0001；(f) 己酸氧化应激实验，P = 0.13530 。每次实验样本数 50 条，样本总150 条。实验结果表明，甲酸对线虫的氧化应激能力无影响，生存曲线同对照组无明 3-2, a)。乙酸同样不具有抗氧化生物活性，不能延长线虫氧化应激条件下的(图 3-2, b)。丙酸处理后的线虫氧化应激条件下的生存曲线同对照组无显著差丙酸不能增强线虫的抗氧化应激能力，不具有体内抗氧化生物活性(图 3-2, c)和戊酸的实验中，两种短链脂肪酸在一定程度上降低了线虫氧化应激的能力线虫氧化应激条件下的存活时间(图 3-2, d-e)，具体原因还不清楚，有待进一

此外，己酸也不具有体内抗氧化生物活性，不能提高线虫的抗氧化应激能力-2, f)。实验结果证明，实验中采用的 6 种传统的短链脂肪酸皆不能增强秀丽隐的抗氧化应激能力，不能延长线虫氧化应激条件下的存活时间。取代短链脂肪酸氧化应激实验中，选取了取代位置和取代烷烃长度不同的取脂肪酸，实验首先检测了 2 号位甲基取代的短链脂肪酸(2ˊ-甲基丙酸、2ˊ-甲基丁ˊ-甲基戊酸、2ˊ-甲基己酸)的体内抗氧化生物活性。
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本文编号：2842523