幽门螺杆菌CagL抗原双抗体夹心ELISA试剂盒的建立

发布时间：2020-10-18 12:51

　　目的:幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是一种重要的致病菌,具有很高的感染性,全球的感染率达到了50%。CagL蛋白是HP的一种伴侣蛋白,是HPⅣ型分泌系统的一种表面蛋白,由hp0539基因序列编码,在启动异常细胞通路引起病理性的临床改变上都起到了重要的作用。本实验利用CagL单克隆抗体和多克隆抗体,建立了可用于检测人粪便样品中的CagL抗原的双抗体夹心ELISA方法,制备并组装了试剂盒,为检测HP的感染提供了有效工具。方法:本实验制备了兔源CagL多克隆抗体,利用CagL单克隆抗体作为一抗包被酶标板,并进行封闭,兔源CagL多克隆抗体作为二抗,再加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗家兔IgG抗体与二抗进行反应,通过加入底物显色以检测样品中是否含有CagL抗原。采用棋盘方阵滴定法,确定一抗的最佳包被浓度及二抗和酶标抗体的最佳稀释度,从而使抗原抗体进行更充分的反应。并且对初步制成的试剂盒进行敏感性、特异性、重复性、稳定性测试,判断试剂盒是否研制成功。结果:采用棋盘滴定法确定一抗的最佳包被浓度为0.048μg/mL,二抗和酶标抗体的最佳稀释度分别为1:32000和1:4000。试剂盒的敏感性试验表明:该方法判读的最低蛋白浓度为9.75μg/ml;特异性试验:表明该方法的特异性较好,不与粪便中的其他菌群发生交叉反应;重复性试验:对10份检测样品进行重复检验,结果显示批内重复和批间重复性均较好,批内变异系数在1.65%~10.5%之间,批间变异系数在1.3%~9.35%之间,基本满足变异系数小于10%,说明该试剂盒的重复性良好;稳定性试验:将包被好的酶标板分别存于37℃和4℃放置105d,每隔15d取出试剂盒对相同样本进行检测,观测其吸光度值的变化。结果表明该试剂盒在105d内检测P/N值均大于2.1满足了该试剂盒的判断标准。以上结果表明,本实验所建立的CagL双抗体夹心ELISA抗原检测方法基本满足敏感性高、特异性强、稳定性好等优点,可进一步应用于临床研究。
【学位单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R392-33
【部分图文】：