羟基法舒地尔对MOG及CPZ诱导的中枢神经系统脱髓鞘小鼠模型的神经保护作用及机制研究

发布时间：2020-10-24 01:37

　　 Rho/ROCK信号通路参与多发性硬化(Multiple Sclerosis,MS)及其动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomylitis,EAE)的病理过程,在免疫细胞活化、炎性细胞经破坏的血-脑屏障(blood brain barrier,BBB)向中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)迁移、髓鞘脱失、轴索损害以及胶质细胞反应等方面扮演着重要的角色。盐酸法舒地尔(Fasudil)是目前临床用于治疗蛛网膜下腔出血后血管痉挛的Rho激酶(Rho kinase,ROCK)抑制剂。有研究表明盐酸法舒地尔具有改善EAE免疫炎性微环境、保护髓鞘等作用,且具备促进神经突触再生的能力和内源性神经干细胞动员的潜能。但是,盐酸法舒地尔同时存在着迅速明显的血管扩张作用、长期使用安全窗较小且给药途径单一、口服生物利用度差、半衰期短等局限性。因此寻求和研发更有效、更安全且副作用更小的新型ROCK抑制剂来治疗神经系统慢性病的任务就显得越来越迫切。羟基法舒地尔(Hydroxyfasudil,HF)是盐酸法舒地尔在体内的活性代谢产物,活性比盐酸法舒地尔强,半衰期更长,并且作为ROCK抑制剂,HF具有更高的选择性。动物实验表明其在恶性肿瘤、肺动脉高压、心脑血管痉挛、心肌缺血、缺血性脑损伤等疾病的预防和治疗中具有潜在价值。因此,在本研究中首先于细胞水平检验HF的细胞毒性、对神经元活性以及形态的影响;其次,通过小鼠急性毒性实验,验证其安全性并了解HF的最大耐受剂量(Maximum Tolerance dose,MTD);继之,在EAE模型验证HF的临床有效性;最后,比较HF以及盐酸法舒地尔在双环己酮草酰二腙(Cuprizone,CPZ)诱导的CNS脱髓鞘模型的疗效,并研究HF对髓鞘的保护以及促进髓鞘再生的作用,探讨其可能的作用机制。第一部分羟基法舒地尔的细胞毒性及其对SHSY-5Y神经元细胞活性、形态的影响目的:观察并比较HF及盐酸法舒地尔的细胞毒性及其对SHSY-5Y神经元细胞活性和形态的影响。方法:SHSY-5Y(人源多巴胺神经细胞系)经标准程序复苏后进行常规培养和传代。待生长状态和细胞密度合适时进行药物干预实验,将神经元与不同浓度的HF及盐酸法舒地尔(3μg,15μg,75μg,200μg/ml)共同培养24h。神经元的活性采用MTT比色法检测。对神经元的细胞毒性测定采用LDH酶标法。SHSY-5Y神经元与HF、盐酸法舒地尔共培养24h后,在显微镜下观察培养状态中的神经元的形态。结果:1.同PBS对照组相比,相对低浓度(3μg/ml,15μg/ml)的HF及盐酸法舒地尔的细胞毒性不显著,随着药物浓度的增加,对SHSY-5Y神经元的毒性增加,特别是当浓度达到200μg/ml时,与PBS组相比,P0.05,差异具有统计学意义。HF与盐酸法舒地尔组间无显著差异。2.同PBS对照组相比,相对低浓度(3μg/ml,15μg/ml)的HF及盐酸法舒地尔并不影响细胞活性,但是当浓度增加至75μg/ml,200μg/ml时SHSY-5Y神经元活性降低,P0.05,差异具有统计学意义。HF与盐酸法舒地尔组间无显著差异。3.相对低浓度(3μg/ml)的HF和盐酸法舒地尔未明显影响SHSY-5Y神经元的形态,当浓度增至15μg/ml时可有效促进神经突的形成,而当浓度增至75μg/ml时可见神经突受损。结论:HF在体外实验中表现出较好的安全性,与盐酸法舒地尔相比无显著差异。第二部分羟基法舒地尔对小鼠的急性毒性实验目的:观察HF对小鼠的急性毒性,评价药物的安全性。方法:第一部分:将36只C57BL/6小鼠(8-10周龄,20-22g)随机分为6组(雌雄各半),即盐酸法舒地尔-80、100、125mg/kg和HF-80、100、125mg/kg。将HF和盐酸法舒地尔溶解于二甲基亚砜(DMSO)中,使用前用0.1%冰醋酸稀释,腹腔注射。DMSO的最终浓度为10%(v/v)。观察小鼠的毒性反应,包括皮毛、进食情况、大小便情况、自主运动情况及不自主运动症状、死亡情况等。第二部分:为了排除酸性溶剂对实验结果的影响,重复100mg/kg和125mg/kg两个浓度组的实验。将16只C57BL/6小鼠随机分成4组(雌雄各半),使用0.9%Na Cl溶解盐酸法舒地尔,HF溶解方法同前。观察小鼠的毒性反应,包括皮毛、进食情况、大小便情况、自主运动情况及不自主运动症状、死亡情况等。结果:1.第一部分实验结果显示:随着药物浓度的增加,小鼠的自主运动逐渐减少,呼吸频率增加,双后肢紧贴地面,无法站立。与HF组相比,相同浓度的盐酸法舒地尔组小鼠自主运动较少,不自主运动增加,抽搐发生率和死亡率较高。盐酸法舒地尔-125mg/kg组小鼠在药物注射2分钟后出现惊厥,随后全身僵硬,然后死亡;相同浓度的HF组小鼠仅表现为自主运动减少,并且没有出现抽搐和死亡现象。2.第二部分结果显示:盐酸法舒地尔-125mg/kg(0.9%Na Cl溶解)组中的两只小鼠在注射药物5分钟后出现惊厥,呼吸速率加快并于30分钟后死亡。其余两只小鼠表现出较少的自主运动,双后肢不能站立。HF-125mg/kg(DMSO+0.1%冰醋酸溶解)组小鼠除了自主活动轻度减少以外,并没有出现抽搐和死亡现象。结论:HF的最大耐受剂量大于125mg/kg,说明HF较盐酸法舒地尔毒性更低,安全性更高。第三部分羟基法舒地尔对实验性自身免疫性脑脊髓炎的防治作用及机制研究目的:建立髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)35-55诱导的EAE小鼠模型,观察HF在EAE模型中的治疗效果,并探讨其可能的分子机制。方法:EAE模型由MOG35-55多肽免疫雌性C57BL/6小鼠制备。随机分为EAE组、HF治疗组。HF于免疫后第3天开始腹腔注射(40mg/kg/d)直至第28天。期间观察小鼠行为学变化。免疫后第28天,取脊髓制备冰冻切片行组织学检测:苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色、卢卡斯快蓝(Luxol Fast Blue,LFB)染色。提取脊髓组织蛋白,通过Western blot法检测NF-κB、COX-2、i NOS的表达。制备脾单个核细胞(Mononuclear cells,MNCs),应用流式细胞仪检测T淋巴细胞亚群;收集MNCs培养上清液,应用ELISA法检测细胞因子;应用Real-time PCR法检测脾MNCs中趋化因子的表达,以及脊髓中M1、M2型巨噬细胞标志物指标。在另一项实验中,建立EAE模型,于免疫后第9天,取脾脏制备MNCs,应用MOG刺激,与HF共培养,检测脾MNCs培养上清液中炎性细胞因子的浓度。结果:1.行为学变化:免疫后第12天EAE组小鼠陆续出现运动功能障碍,平均发病时间为免疫后(16.38±4.98)天,且随时间延长,临床症状加重,评分逐渐增高,EAE组小鼠的临床症状的平均最高分值为(3.84±1.09)分,HF治疗组小鼠则未出现可测的运动障碍表现,两组之间差异显著(P0.01,P0.001)。2.组织学检测:脊髓冰冻切片HE染色显示:EAE小鼠脊髓白质内大量炎性细胞密集环绕于小血管周围,呈血管“袖套样”改变。EAE组炎性细胞浸润面积占白质总面积的(1.15±0.09)%,HF治疗组为(0.64±0.18)%,炎性细胞的浸润明显减少,两组比较有统计学意义(P0.01)。LFB染色可见EAE小鼠脊髓白质内片状髓鞘脱失区。EAE组髓鞘脱失区占白质总面积的(1.20±0.16)%,HF治疗组为(0.37±0.02)%,显著减少了脊髓白质内髓鞘的脱失(P0.01)。3.流式细胞术检测HF对EAE小鼠脾MNCs中T淋巴细胞亚群变化的影响。结果显示,与EAE组相比,HF可上调CD4+CD25+T细胞的比例(P0.05);下调CD4+IFN-γ+(P0.05)和CD4+IL-17+T(P0.05)细胞的比例。同时,与EAE组相比,HF可抑制脾MNCs培养上清液中IFN-γ和IL-17的表达(P0.05)。4.Real-time PCR检测巨噬细胞标志物的表达,结果显示,与EAE组相比,HF增加了M2型巨噬细胞标志物Arg-1(P0.05)、IL-4(P0.01)、TGF-β(P0.01)的表达,并抑制M1型巨噬细胞标志物i NOS(P0.001)、CD68(P0.001)和TNF-α(P0.001)的表达。5.HF抑制了EAE小鼠脊髓内p-NF-κB/p65的表达(P0.05),而且降低了COX-2和i NOS的水平(P0.05,P0.05)。6.体外实验结果显示:HF降低了脾MNCs培养上清液中炎性细胞因子IFN-γ、IL-17、TNF-α和IL-1β的浓度(P0.05),并抑制了趋化因子MIP-1a(p0.05)、MCP-1(P0.01)、RANTES(P0.01)的表达。结论:1.成功制备MOG35-33诱导的小鼠EAE模型;2.HF可延迟EAE小鼠模型的发病时间,改善CNS的髓鞘脱失,减轻临床症状的严重性;3.HF通过减少脾细胞中趋化因子的表达起到抑制炎性细胞向CNS浸润的作用;4.HF通过促进T细胞各亚群间的平衡而发挥免疫调节作用;5.HF通过下调致炎性细胞因子,促进巨噬细胞表型由M1向M2型转变,并抑制NF-κB的活化,下调i NOS和COX-2的表达起到缓解神经炎性反应的作用。第四部分羟基法舒地尔、盐酸法舒地尔治疗双环己酮草酰二腙诱导的脱髓鞘模型的疗效比较及作用机制研究目的:比较HF与盐酸法舒地尔对CPZ诱导的脱髓鞘小鼠模型的治疗效果,并探究其作用机制。方法:将雄性C57BL/6小鼠随机分为四组:正常组:接受常规饲料喂养6周;CPZ模型组:投喂含0.2%CPZ(w/w)的饲料6周;盐酸法舒地尔治疗组:投喂含0.2%CPZ(w/w)的饲料6周,于造模四周后给予腹腔注射盐酸法舒地尔(40mg/kg/d);HF治疗组:投喂含0.2%CPZ(w/w)的饲料6周,于造模四周后给予腹腔注射HF(40mg/kg/d)。正常组及CPZ模型组于四周后给予腹腔注射等量生理盐水。于实验结束时应用高架十字迷宫(EPM)和垂直木实验来检测小鼠的焦虑水平和运动能力。应用LFB和黑金染色(Black GoldⅡ,BGⅡ)对脑冰冻切片进行染色,以及Western blot法检测髓鞘碱性蛋白MBP的表达,免疫荧光染色法检测MBP的表达以及脑内成熟少突胶质细胞的数量来评估CPZ小鼠脑内髓鞘的脱失程度。分离脾脏并称取重量,制备脾MNCs,一部分MNCs通过流式细胞术检测T细胞亚群的分布、B细胞的比例;另一部分脾MNCs在含有MOG35-55(10μg/ml)的培养液中培养48小时。采用ELISA法检测各组小鼠脑内、血清以及脾MNCs培养上清液中细胞因子的浓度。应用ELISA法检测血清、脾MNCs培养上清液以及脑组织中的抗-MOG抗体,并应用Dot blot法和免疫荧光染色法检验其特异性。通过免疫荧光染色法,检测脑内抗-CD4、CD68、B220、Iba-1、i NOS,NF-κB和BDNF的表达。结果:1.与正常组相比,CPZ模型组小鼠表现出明显的行为学的改变,EPM检测结果显示,CPZ模型组小鼠进入闭合臂的次数明显增加(正常组为4.75±0.93,CPZ模型组为10.08±1.89,P0.01)。同CPZ模型组相比,盐酸法舒地尔组(6.58±1.04)及HF组(5.83±0.79)有效地减少了CPZ小鼠进入闭合臂的次数(P0.05,P0.05),但是盐酸法舒地尔组及HF组之间无显著差异。垂直木检测结果显示CPZ模型组小鼠自检测装置顶端至底部所需时间较正常组明显增加,正常组为(5.72±0.83)s,CPZ模型组为(15.29±1.24)s,P0.01。与CPZ模型组相比,盐酸法舒地尔组为(11.71±1.01)s,P0.05,HF组为(10.14±1.10)s,P0.05,有效地改善了CPZ小鼠的运动能力。但是盐酸法舒地尔组及HF组之间的差异未达到统计学意义。2.同正常组相比,CPZ模型组小鼠脑内胼胝体区LFB光密度、BGⅡ染色密度及MBP的表达均明显降低(P0.001)。同CPZ模型组相比,HF组及盐酸法舒地尔组各染色法结果均显示小鼠脑内髓鞘的脱失明显减轻(P0.01,P0.001)。盐酸法舒地尔组BGⅡ染色法的光密度值高于HF组,该差异具有统计学意义(P0.05)。3.CPZ模型组小鼠脑蛋白中MBP含量比正常组减少(P0.001)。同CPZ模型组相比,盐酸法舒地尔组及HF组脑蛋白中MBP的含量明显增加(P0.001)。盐酸法舒地尔组MBP的表达高于HF组,差异显著,具有统计学意义,P0.05。同正常组相比,CPZ模型组O4+少突胶质细胞数量明显减少(正常组为396.61±29.74,CPZ模型组94.23±9.23,P0.001)。盐酸法舒地尔组(255.80±25.11)及HF组(258.24±26.37)较CPZ模型组相比,可有效增加O4+少突胶质细胞的数量(P0.001)。盐酸法舒地尔组及HF组之间无显著差异。4.CPZ组小鼠的脾脏质量较正常组明显减小,正常组为(113.50±14.92)g,CPZ模型组为(57.13±2.65)g,P0.001。盐酸法舒地尔组脾脏质量为(70.77±5.16)g,HF组为(65.83±3.04)g,同CPZ模型组相比,二者均可部分程度上改善CPZ所诱导的脾脏萎缩(P0.05)。盐酸法舒地尔组及HF组之间差异不显著。5.通过ELISA法于CPZ小鼠的血清、脾MNCs培养上清液以及脑蛋白中均检测到抗-MOG抗体,同正常组相比,差异具有统计学意义(P0.001,P0.01,P0.05),盐酸法舒地尔及HF可显著抑制CPZ小鼠血清、脾MNCs培养上清液以及脑蛋白中抗-MOG抗体的浓度(P0.001,P0.01),并且同盐酸法舒地尔相比,HF对抗-MOG抗体的抑制作用更强,两组差异具有统计学意义(P0.05)。应用Dot blot法检验不同稀释比例的血清中抗-MOG抗体的表达,CPZ模型组显著高于正常组,P0.001,盐酸法舒地尔和HF表现出对该抗体的有效抑制,与CPZ模型组相比差异显著(P0.001,P0.01)。HF较盐酸法舒地尔的抑制作用更显著(P0.05)。通过免疫荧光染色法验证了抗-MOG抗体可特异性地与少突胶质细胞结合。应用流式细胞术分析脾MNCs中B淋巴细胞亚群的比例,正常组、CPZ模型组、盐酸法舒地尔组及HF组分别为:(52.37±0.52)%,(62.17±0.13)%,(54.87±0.59)%,(52.97±0.23)%,与正常组相比,CPZ模型组的B220+B细胞比例增加(P0.001)。而与CPZ模型组相比,盐酸法舒地尔及HF可抑制这一改变(P0.001),并且HF组同盐酸法舒地尔组相比,该比例更低,差异具有统计学意义(P0.05)。6.在CPZ模型小鼠脑内,可观察到CD4、CD68以及B220阳性的T淋巴细胞、巨噬细胞和B淋巴细胞的表达,同正常组相比,差异显著(P0.001)。盐酸法舒地尔及HF可显著抑制上述细胞向CPZ小鼠脑内的浸润(P0.001)。7.同正常组相比,CPZ模型小鼠脑内胼胝体区以及纹状体区可见Iba-1+小胶质细胞的数量的显著增加(P0.001);与CPZ模型组相比,盐酸法舒地尔及HF可有效地减少CPZ小鼠脑内该细胞的数量(P0.001);盐酸法舒地尔组及HF组之间无显著差异。应用双染技术,可见CPZ模型组小鼠脑内Iba-1+i NOS+以及Iba-1+NF-κB+的细胞数量较正常组明显增加(P0.001),盐酸法舒地尔及HF可有效地减少CPZ小鼠脑内上述炎性细胞的数量,同CPZ模型组相比,差异显著,P0.001,而盐酸法舒地尔及HF组之间无显著差异。盐酸法舒地尔及HF尚可抑制脑内炎性细胞因子IL-4(P0.001)、IL-1β(P0.001)和TNF-α的水平。8.HF促进了星形胶质细胞来源的BDNF的产生。结论:1.HF及盐酸法舒地尔可通过抑制抗-MOG特异性抗体的产生,抑制小胶质细胞介导的神经炎症、抑制外周炎性细胞浸润进而改善炎性微环境等作用来发挥对CPZ模型髓鞘的保护作用。2.HF还可促进神经营养因子的产生来促进髓鞘的再生。此外,同盐酸法舒地尔相比,HF表现出更强的抑制抗-MOG抗体的作用。结论1.HF的细胞毒性及其对细胞活性、细胞形态的影响呈浓度依赖型表现。2.HF的最大耐受剂量高于盐酸法舒地尔,具有较好的安全性。3.HF可改善EAE模型的临床症状,减轻脊髓中炎性细胞浸润,改善髓鞘脱失,并通过调节免疫、抑制神经炎性反应等途径发挥作用。4.HF及盐酸法舒地尔可通过抑制抗-MOG特异性抗体的产生,抑制小胶质细胞介导的神经炎症、改善炎性微环境,促进神经营养因子的产生等作用来发挥对CPZ模型的髓鞘保护以及促进髓鞘再生的作用。5.HF作为盐酸法舒地尔在体内的活性代谢产物,二者在治疗CPZ模型中疗效相近,但是同盐酸法舒地尔相比,HF具有对抗-MOG特异性抗体的抑制作用更强、毒性更低、不良反应更低的优势,具有很大的潜在应用价值。
【学位单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R744.5;R-332
【部分图文】：

山西医科大学博士学位论文2 结 果 不同浓度 HF 和盐酸法舒地尔对 SHSY-5Y 神经元的细胞毒性检测如图 1-1 所示，同 PBS 对照组相比，相对低浓度（3μg/ml，15μg/ml）的 H法舒地尔细胞毒性不显著，随着药物浓度的增加，二者均可浓度依赖Y-5Y 神经元产生毒性，特别是当浓度达到 200μg/ml 时，对 SHSY-5Y 神经显著，与 PBS 组相比，P<0.05，差异具有统计学意义。HF 与盐酸法舒地 SHSY-5Y 神经元的细胞毒性无显著差异。

图 1-2 HF 和盐酸法舒地尔对 SHSY-5Y 神经元细胞活性的影响（*P＜0.05）3 不同浓度 HF 和盐酸法舒地尔对 SHSY-5Y 神经元形态的影响如图 1-3 所示，同 PBS 对照组相比，相对低浓度（3μg/ml）的 HF 和盐酸法舒尔未明显影响 SHSY-5Y 神经元的形态，当浓度增至 15μg/ml 时可有效促进SY-5Y 神经元的神经突的形成，而当浓度增至 75μg/ml 时可见神经突受损。

图 1-2 HF 和盐酸法舒地尔对 SHSY-5Y 神经元细胞活性的影响（*P＜同浓度 HF 和盐酸法舒地尔对 SHSY-5Y 神经元形态的影响 1-3 所示，同 PBS 对照组相比，相对低浓度（3μg/ml）的 HF 和明显影响 SHSY-5Y 神经元的形态，当浓度增至 15μg/ml 时可Y 神经元的神经突的形成，而当浓度增至 75μg/ml 时可见神经突受
【参考文献】

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1 张海飞;郭敏芳;孟健;刘春云;李艳花;尉杰忠;侯绍蔚;丰玲;肖保国;马存根;;法舒地尔对LPS刺激小胶质细胞表型演变的影响[J];细胞与分子免疫学杂志;2012年08期

本文编号：2853834