小肠结肠炎耶尔森菌在中国宿主动物间分布特征与致病性小肠结肠炎耶尔森菌ystA基因功能研究

发布时间：2017-04-04 11:01

  本文关键词：小肠结肠炎耶尔森菌在中国宿主动物间分布特征与致病性小肠结肠炎耶尔森菌ystA基因功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：小肠结肠炎耶尔森菌是一种常见的肠杆菌科细菌,该菌造成的感染近年来受到全球广泛关注。该菌还是一种人兽共患病病原体,动物宿主类型比较广泛。本研究的主要目的是研究小肠结肠炎耶尔森菌在中国不同地区多种宿主动物间的分布特征。标本采集的时间跨度是从2008年7月至2014年7月,采样地区包括16个省市(青海省,四川省甘孜州石渠县和德格县,甘肃省、宁夏回族自治区、内蒙古自治区、云南省、贵州省、四川省绵阳市和资阳市、黑龙江省、河南省、北京市、广西壮族自治区江西省、安徽省、江苏省、浙江省)。采样动物包括生猪11403只(标本12319份),犬1632只(标本2687份),羊1677只(标本2325份),牛648只,鸡1199只,鸭子17只,老鼠14191只(标本18436份),高原鼠兔207只(标本414份),蝙蝠368只。各种动物宿主携带率如下：猪携带率12.91%；犬携带率9.80%；羊携带率0.89%；牛携带率2.78%；鸡携带率4.50%；鸭子携带率是0；老鼠携带率3.40%；高原鼠兔携带率6.76%；蝙蝠携带率是0。从所有标本中,共分离得到小肠结肠炎耶尔森菌2289株,其中致病性菌株1232株,非致病性菌株1057株。致病性菌株中绝大多数为0：3血清型,占99.51%(1226/1232),O：9致病性血清型菌株仅有6株。不同的动物宿主中致病菌的分离率有较大差别,其中,猪、犬标本中分离的多是致病性小肠结肠炎耶尔森菌,比例分别为73.50%,59.44%；而羊、牛、鸡、老鼠和高原鼠兔中分离的非致病性菌株占多数。本研究选取的菌株是Y.E 105.5R(r),该株菌是一株全基因测序的人源性菌株,血清型是O：9。本研究利用自杀质粒同源重组的原理,获得了Y.E 105.5R(r)△ystA和Y.E 105.5R(r) △ystA ail两种衍生菌株。将野生株与两种衍生菌株,分别进行乳鼠试验。利用乳鼠肠重/余体重的比值来检验这三种菌产生肠毒素的水平。本次研究运用单因素方差分析对三组数据进行比较,检验水准a=0.05。结果显示：三组数据之间存在明显的统计学差异,检验效能(power)是0.888；其中Y.E105.5R(r)与Y.E 105.5 R(r)△ystA之间两两比较的结果为P=0.006,power=0.909；Y.E105.5R(r)和Y.E 105.5R(r)△ystA ail之间两两比较的结果为P=0.032,power=0.933而YE 105.5R(r)△ystA和Y.E105.5R(r)△ystA ail之间两两比较的结果P=0.985,power=0.059。统计学结果提示O:9血清型小肠结肠炎耶尔森菌ystA基因在37℃乳鼠体内能够表达。
【关键词】：小肠结肠炎耶尔森菌 动物宿主 肠毒素 ystA基因 乳鼠试验
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378
【目录】：

• 缩略词7-8
• 中文摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 前言12-15
• 第一部分 小肠结肠炎耶尔森菌在中国家畜家禽及野生动物间分布15-28
• 1. 实验材料与方法15-21
• 1.1 仪器与材料15-17
• 1.1.1 实验仪器15
• 1.1.2 主要生化试剂15-16
• 1.1.3 培养基与试剂配制16-17
• 1.2 实验方法17-21
• 1.2.1 标本采集17
• 1.2.2 标本DNA的提取17
• 1.2.3 PCR初筛标本17-18
• 1.2.4 菌株分离培养18
• 1.2.5 生化鉴定与血清型鉴定18-19
• 1.2.6 毒力基因鉴定19-21
• 2. 结果与分析21-25
• 2.1 各地区家畜家禽、野生动物标本采集及菌株分离情况21
• 2.2 致病性小肠结肠炎耶尔森菌分离及血清型分布情况21
• 2.3 部分家畜家禽和野生动物对应标本的采集及菌株分离情况21-25
• 3. 讨论25-27
• 4. 小结27-28
• 第二部分 致病性菌株ystA基因功能研究28-48
• 1. 目的基因缺失株构建28-38
• 1.1 实验材料28-31
• 1.1.1 实验菌株与质粒28
• 1.1.2 实验仪器28
• 1.1.3 实验培养基配制28-29
• 1.1.4 实验引物29-31
• 1.2 实验方法31-38
• 1.2.1 重组质粒构建31-38
• 2. 乳鼠灌胃实验38-39
• 2.1 实验菌株与动物筛选38
• 2.2 实验动物分组38
• 2.3 灌胃实验菌液制备38
• 2.4 菌落计数38-39
• 2.5 乳鼠灌胃实验39
• 3. 实验结果39-45
• 3.1 小肠结肠炎耶尔森菌Y.E 105.5R(R)两种衍生菌株构建39-42
• 3.1.1 小肠结肠炎耶尔森菌Y.E 105.5R(r)基因组DNA提取及ail基因、ystA基因同源臂的扩增39-40
• 3.1.2 YE 105.5R(r)△ystA、Y.E 105.5R(r)△ail、YE 105.5R(r)△ystA ail PCR筛选40-42
• 3.2 乳鼠灌胃实验结果42-45
• 3.2.1 质粒验证结果42-43
• 3.2.2 三株菌菌落计数结果43
• 3.2.3 乳鼠灌胃后肠重与余体重数据43-44
• 3.2.4 数据分析44-45
• 4. 讨论45-48
• 5. 小结48
• 参考文献48-51
• 附录1：综述51-59
• 参考文献55-59
• 致谢59-60
• 个人文章发表情况60

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