G蛋白偶联受体激酶2杂合子敲除小鼠构建及表型鉴定

发布时间：2020-10-24 14:32

　　 目的应用CRISPR/Cas9技术构建G蛋白偶联受体激酶2(GRK2)杂合敲除(GRK2~(+/-))小鼠,用于疾病病理机制及药物靶点研究。方法构建靶向敲除GRK2基因的载体,在体外将先导RNA和Cas9 mRNA显微注射到C57BL/6小鼠的受精卵中,在小鼠GRK2基因的第3个外显子上造成基因突变,通过PCR及基因测序测定F0代基因型,成功获得13bp和19bp敲除两种GRK2~(+/-)小鼠。因GRK2纯合子敲除胚胎期死亡,将19bp敲除F0代小鼠与C57BL/6小鼠回交,获得稳定的19bp敲除F1代GRK2~(+/-)小鼠用于扩繁及实验。结果 GRK2~(+/-)小鼠基因型稳定,体重较同龄C57BL/6小鼠低,Western blot检测证实GRK2~(+/-)小鼠心脏、脾脏、胸腺、肝脏、巨噬细胞及肾脏组织中GRK2蛋白的表达均显著降低。结论该研究利用CRISPR/Cas9技术成功建立了GRK2~(+/-)小鼠模型,为进一步研究GRK2在多种脏器、细胞发育中的作用,疾病发病机制及药物作用靶点提供了重要的动物模型。
【部分图文】：

将体外转录的sgRNA与Cas9 mRNA混合后显微注射到C57BL/6小鼠受精卵中,将受精卵移植进C57BL/6雌性小鼠体内,生产出10只F0代小鼠。表1 sgRNA PCR退火程序的反应体系 反应条件 体积(μl) S1 oligos 1.0 S2 oligos 1.0 10× T4 ligation buffer 1.0 T4 PNK 0.5 双蒸水 6.5 总体积 10.0

将体外转录扩增的sgRNA与Cas9 mRNA的混合物显微注射入C57BL/6小鼠受精卵中,获得10只F0代小鼠,编号为1#-7#、8#-1、8#-2、9#,提取尾部DNA经PCR扩增后进行测序(图2A和2B),测序结果表明CRISPR/Cas9系统作用于GRK2基因的19号染色体的第三个外显子上,其中2#小鼠删除了19 bp碱基,3#、4#小鼠删除了20 bp碱基,8#-1小鼠缺失13 bp碱基,8#-2虽然缺少了1 bp碱基但却插入了16 bp碱基导致插入了15 bp碱基,9#插入了21 bp碱基。由于8-2#,9#小鼠插入的碱基个数是3的倍数,因此未能实现基因的确定突变,因此得到4只F0代GRK2+/-小鼠。2.2 获得GRK2基因杂合敲除F1代小鼠

GRK2属于丝/苏氨酸激酶家族,磷酸化GPCRs,GRK2与β-arrestin共同调控GPCRs的脱敏及内吞,为GRK2最经典的作用[8],最近研究[2]表明GRK2也可直接磷酸化微管蛋白、核糖体蛋白、钠通道及参与ERK、MAPK和NF-κB等信号通路的调控,并且通过诱导Smad磷酸化来调节转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)介导的细胞生长停滞和凋亡,在细胞的生长发育中起到关键作用。因此,GRK2在多种慢性疾病包括心血管疾病、神经系统疾病、自身免疫病以及肿瘤的发生和发展中起到了重要作用。图4 F2代小鼠基因鉴定
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本文编号：2854584