Smurf1促进Lhx9降解并抑制睾丸间质细胞的睾酮合成功能

发布时间：2020-10-24 19:16

　　 目的:睾酮对男性生殖系统的发育和功能至关重要,包括促进精子发生和维持男性第二性征。作为转录因子的Lhx9维持着生殖系统的正常发育,决定着不同类型的性腺细胞的分化并参与睾酮的合成。但到目前为止,对Lhx9的研究主要集中于它调控的靶向分子,对Lhx9本身的调控,特别是其翻译后修饰仍不清楚。蛋白质的泛素化修饰是一种重要的翻译后修饰,在生命活动的多个方面起着重要作用。本论文旨在研究Lhx9的翻译后修饰是否会影响睾丸间质细胞合成睾酮的能力。方法:本论文应用了 HEK293T细胞系、TM3细胞系进行分子水平的实验,其中涉及到蛋白免疫印迹技术,定量PCR技术,免疫共沉淀技术,间接免疫荧光技术,慢病毒和小干扰RNA敲低蛋白表达的实验,原核蛋白诱导表达和Pull-down实验,双荧光素酶报告基因实验;应用了原代睾丸间质细胞进行了细胞功能的研究,其中涉及到,定量PCR技术和体外hCG刺激睾酮分泌的实验;应用了 Smurf1基因敲除小鼠进行了动物水平的观察,其中涉及到免疫组化技术,酶联免疫吸附试验,放射免疫方法检测激素水平的实验。结果:本研究发现1)hCG刺激以剂量依赖性和时间依赖性方式增加原代小鼠睾丸间质细胞的睾酮分泌。在这一过程中,睾丸间质细胞中的Lhx9蛋白质水平增加、转录水平不变,并且发现Lhx9可以被泛素修饰,经蛋白酶体途径被降解。2)Smurf1负向调控Lhx9蛋白表达而不影响Lhx9的转录水平。Smurf1过表达细胞中Lhx9蛋白的半衰期缩短。相反,Smurf1敲低的细胞中Lhx9蛋白的稳定性增加。此外,Smurf1敲除的胚胎成纤维细胞也表现出更稳定的Lhx9表达。3)Smurf1促进Lhx9的泛素化修饰和降解,Smurf1过表达细胞中Lhx9的泛素化水平增强,而Smurf1敲除的胚胎成纤维细胞中观察到Lhx9的泛素化水平减弱。4)Smurf1可以和Lhx9发生直接相互作用。Smurf1的HECT结构域和Lhx9的LIM1、LIM2结构域介导了这两个分子之间的相互作用。在TM3细胞系和HSD3B1阳性的原代睾丸间质细胞中观察到了 Lhx9和Smurf1主要共定位于细胞核中。5)通过报告基因实验,发现Smurf1负调节Lhx9的转录活性。6)Smurf1敲除小鼠的睾丸间质细胞中Lhx9、CYP17A1和HSD3B1蛋白表达上调,并且睾酮合成过程中重要基因(NR5A1,STAR,CYP17A1,HSD3B1,HSD3B6和HSD17B3)的转录水平均上调。Smurf1敲除小鼠的睾丸间质细胞相比于野生型,在hCG刺激下合成了更多的睾酮。7)Smurf1敲除小鼠的血清睾酮含量,在不同年龄阶段都高于野生型对照,但血清中黄体生成素的水平与野生型没有显著差异,并且在睾丸组织中有更高的Lhx9蛋白表达。通过免疫组织化学分析,Smurf1敲除小鼠睾酮中HSD3B1和CYP17A1表达显着高于野生型小鼠。Smurf1敲除小鼠的睾丸中NR5A1,CYP17A1,HSD3B1,HSD3B6,HSD17B3和STAR的转录水平亦增加。结论:本研究揭示了 Smurf1促进Lhx9泛素化修饰并介导了 Lhx9的降解,抑制了睾丸间质细胞中的睾酮合成。本研究结果增加了对体内睾酮合成调节机制的新认识,将泛素化修饰,这一重要蛋白质翻译后修饰,与睾酮的稳态调控联系在了一起。Smurf1可能成为调节睾酮水平的靶点,已发现一些小分子化合物可以抑制Smurf1的泛素连接酶的功能。这些化合物的使用为通过靶向Smurf1抑制其泛素连接酶活性,为增加睾酮合成提供了新的策略。
【学位单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R339.2
【部分图文】：

２?Ａ?１０?Ｂ?８??Ｈ（ｙ??图１丄１环戊基菲四环结构（８）??首先，我们回顾一下睾酮在睾丸间质细胞中合成的过程（图１．１．２）。??第一步是胆固醇的获取及转运。人体细胞中的大部分胆固醇来自膳食吸收后??１１??

?解放军医学院博士学位论文解途径中的关键酶，其中已糖激酶２（ＨＫ２），磷酸果糖激酶（ＰＦＫ）和脱氢酶（Ｇ６Ｐ）??表达增加，这导致通过磷酸戊糖途径或丙酮酸柠檬酸循环途径的葡萄糖利用增加??（３１）；?４）睾酮增加糖原合成酶（糖原合成中的限速酶）的活性，而降低糖原磷酸??化酶活性，这样就减少糖原分解使细胞中游离葡萄糖的水平降低（３２）。??Ｉｎｓｕｌｉｎ?〇?０?Ｇｌｕｃｏｓｅ?？?／ｆＮ??

?解放军医学院博士学位论文???的下丘脑一垂体一性腺轴对睾酮的调控之外，很多组织和分子都参与到了睾酮的??调控，例如骨组织分泌的骨钙素作用于睾丸间质细胞以刺激睾酮，大脑和睾丸之??间的直接神经联系导致睾酮产生的快速抑制。同时还有很多小ＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）??参与调控睾酮的生成，例如睾酮生成过程中起负调控作用的ｍｉＲ－１２５ａ、ｍｉＲ－４５５??和ｍｉＲ－１５０。但是针对分子水平的不同修饰（磷酸化、乙酰化、泛素化）的作用来??调控睾酮的合成的报道仍较少。??
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本文编号：2854875