干扰Hi-Lnc70和miR-375对人胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的影响

发布时间：2020-10-26 06:04

　　 人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)来源于囊胚内细胞团,可以长期维持自我更新,并具有分化形成各种组织细胞的潜能。hESCs在特定条件下可分化为胰岛素分泌细胞(insulin-producing cells,IPCs),用于移植治疗Ⅰ型糖尿病,解决临床治疗器官来源不足的问题。MiR-375是胰腺发育和成熟过程中必不可少的转录调控因子,在胰岛β细胞和非β细胞中均有表达,能够提高胰岛素转录水平,促进胰岛β细胞增殖。Hi-Lnc70是在胰岛β细胞发育过程中特异性高表达的lncRNA,影响β细胞形成和生理功能。因此,研究miR-375和Hi-Lnc70在hESCs向IPCs分化过程中的作用,对于提高hESCs向IPCs分化的效率,获得单一表达Insulin的成熟胰岛β细胞具有重要意义。本实验所使用的hESCs向IPCs分化方案包括定形内胚层(Stage I)、原肠(Stage II)、内分泌前体(Stage III)和胰腺内分泌细胞(Stage IV)四个阶段。通过在分化的不同阶段对胰腺发育相关基因和Hi-Lnc70和miR-375的检测,发现在向定形内胚层分化阶段的培养液中添加25 ng/mL wnt3a的方案,能维持细胞良好的生长状态,同时高表达胰腺发育成熟相关基因。同时根据已经发表的人Hi-Lnc70的抑制序列,构建Hi-Lnc70的RNA干扰载体。对分化不同时期的hESCs进行脂质体介导的Hi-Lnc70抑制质粒转染,发现瞬时抑制Hi-Lnc70可提高Pdx1、Insulin、Glucagon和Somatostatin表达水平,促进PDX1蛋白、胰岛素、胰高血糖素和生长激素抑制素的合成。对分化不同时期的hESCs进行脂质体介导的miR-375 mimic转染,发现瞬时过表达miR-375,可提高Pdx1、Insulin表达水平并促进PDX1蛋白和胰岛素合成,同时降低Glucagon和Somatostatin表达水平,减少胰高血糖素和生长激素抑制素的合成,进而降低细胞多激素共表达程度。对分化不同时期的hESCs进行脂质体介导的miR-375 inhibitoror转染,发现瞬时抑制miR-375,可降低Pdx1、Insulin、Glucagon和Somatostatin表达水平,减少PDX1蛋白、胰岛素、胰高血糖素和生长激素抑制素的合成。本研究证明在hESCs向IPCs分化过程中抑制Hi-Lnc70和过表达miR-375可提高胰岛β细胞发育成熟相关基因的表达水平。提高分化过程中细胞miR-375水平可以降低分化末期细胞多激素共表达程度,促进β细胞成熟和胰岛素合成。抑制miR-375则降低胰岛β细胞发育成熟相关基因的表达水平,为深入研究非编码RNA在胰岛发育中的作用提供了新的思路。
【学位单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R329.2
【部分图文】：

引自 Non-Coding RNA in Pancreas and β-Cell Develo输miRNA 在细胞内被分选并随后选择性地分泌到细于细胞间信号传导至关重要[102, 103]。包裹在微泡（ AGO2[105]或脂蛋白[106, 107]结合的 miRNA 都可以被能。多泡体（MVB）是含有多个小囊泡的内体的特化小）在 MVB 与质膜融合后释放。通过质膜的向外出m），随后释放到细胞外空间中。外泌体内的 miRN同时表明外泌体 miRNA 转移是一种选择性过程[108-1转移，而且还可以保护它们免受 RNase 降解，由于

图 2 不同浓度 Wnt3a 对 hESCs 在分化培养液中生长状态的影响Stage I、Stage II、Stage III 和 Stage IV 分别表示分化阶段，wnt3a + 、wnt3a ++和 wnt3a 分别表示 25ng/mLwnt3a、50ng/mL 和不添加 wnt3a 的方案。（标尺为 200 μm）Figure 2 Effects of different concentration of Wnt3a on morphology of hESCs at different stagesStage I, Stage II, Stage III and Stage IV indicate stages of differentiation, wnt3a + ,wnt3a ++ and wndicate the medium of the first protocol of adding 25 ng/mLwnt3a, 50 ng/mLwnt3a and without wnt3a. (The s200 μm)1.2 不同浓度 Wnt3a 对人胚胎干细胞定向分化为胰岛 β 细胞的影响如图 3 所示，以未分化的细胞作为对照，Gapdh 作为内参基因，通过实时荧光定量 P方法，检测所有鉴定细胞中胰向分化相关基因 Somatostatin、Glucagon、Insulin、Pdx1、Ngnxcr4 和 Foxa2 的表达。分析整个分化的趋势，Foxa2 和 Cxcr4 作为终末内胚层标志性基因

30图 3 不同浓度 Wnt3a 对 hESCs 向 IPCs 分化过程中胰腺相关基因相对表达量的影响Stage I、Stage II、Stage III 和 Stage IV 分别表示分化阶段，wnt3a + 、wnt3a ++和 wnt3a 分别表示 25ng/mLwnt3a、50ng/mL 和不添加 wnt3a 的方案。
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本文编号：2856606