sh-ASIC3慢病毒对小鼠转移皮肤癌痛作用的研究
发布时间：2020-10-27 12:39
目的:构建酸敏感离子通道3(Acid-sensing ion channels 3,ASIC3)基因干扰质粒,验证重组质粒干扰效率,并获得sh-ASIC3慢病毒;建立小鼠转移皮肤癌痛模型并行sh-ASIC3慢病毒鞘内注射处理,研究ASIC3在转移皮肤癌痛模型小鼠中的作用。方法:利用GenBank获取ASIC3基因序列合成相应干扰序列,通过T4 DNA连接酶将ASIC3基因片段连接至环状Plko.1-Puro载体上,获得重组干扰ASIC3质粒(sh-ASIC3),通过转染三种神经细胞(PC12、N2a、BV2),运用实时荧光定量PCR(RT-PCR)和免疫印迹技术(Western blotting)验证sh-ASIC3质粒干扰效率。随后将重组质粒转染293T细胞获取sh-ASIC3慢病毒,运用实时荧光定量PCR技术检测病毒滴度。于健康雌性Balb/c小鼠左后趾皮下注射小鼠乳腺癌细胞(4T1),数量约2×10~5个,建立小鼠转移皮肤癌痛模型。建模成功后运用完全随机数字表法将小鼠进行分组处理,各组小鼠分别在接种4T1后隔天测量小鼠热缩足反射潜伏期(Paw Withdrawal Thermal Latency,PWTL),在接种4T1癌细胞成功的小鼠第9天按实验分组行鞘内及局部注射慢病毒处理,随后隔天行PWTL测试,比较慢病毒处理前后PWTL阈值的变化。慢病毒处理13天后采用脊髓离断法处死小鼠,获取L4-5脊髓背根神经组织。运用免疫组化技术检测脊髓背根神经(dorsal root ganglion,DRG)中ASIC3的变化。结果:菌液PCR结果提示ASIC3干扰序列插入载体成功,测序结果表明干扰质粒ASIC3的插入序列与Genbank标准序列完全一致;RT-PCR及Western blo tting检测结果表明,三种神经细胞中mRNA转录水平及蛋白表达量sh-ASIC3慢病毒感染组较sh-EGFP慢病毒感染组明显降低,差异有统计学意义(P0.05);小鼠左后趾皮下注射4T1癌细胞后,接种侧出现明显红肿及活动障碍,PWTL测试阈值较正常组缩短,且RT-sqPCR及Western blotting结果提示接种4TI癌细胞小鼠DRG中ASIC3表达量较正常组明显增高;皮肤癌痛小鼠行鞘内注射sh-ASIC3干扰慢病毒处理后较肿瘤局部注射sh-ASIC3干扰慢病毒及鞘内注射sh-E GFP干扰慢病毒组PWTL测试阈值明显增高,小鼠DRG中ASIC3免疫组化结果同样与PWTL结果一致。结论:成功构建sh-ASIC3慢病毒干扰质粒;皮下注射乳腺癌细胞的雌性小鼠PWTL较正常小鼠明显缩短,且ASIC3表达量同时增高,表明成功建立皮肤癌痛模型小鼠,并说明ASIC3介导小鼠皮肤癌痛的产生;鞘内注射sh-ASIC3慢病毒可提高癌痛小鼠PWTL阈值,免疫组化结果进一步佐证了其机制可能与ASIC3表达的下调有关。
【学位单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R739.5;R-332
【部分图文】：
图 1 ASIC 存在于外周神经末梢&肿瘤与感觉神经元的联系Fig 1 ASIC exists in peripheral nerve endings & The connection between tumor and sensory neurons感性，但会降低机械感受器对有害刺激的敏感性[21]。有研究者认为外周致敏是骨癌疼痛的主要诱因，周围感觉神经通常受神经支配的组织的纤维被骨癌和癌症相关免疫细胞释放的产物激活和敏化，受影响的背根神经节（DRG）神经元表现出异位自发活动和过度兴奋，这部分导致严重的持续慢性疼痛[22,23]。位于疼痛感觉神经元胞体以及神经纤维膜表面的受体或离子通道是感知各种伤害性刺激的重要结构，因此，癌性疼痛的产生与相关受体或离子通道性状的改变密切相关。随着近年来癌性疼痛的研究逐渐增多，尤其是分子机制的研究，旨在为癌性疼痛的
图 2.1 A: 3 种 sh-ASIC3 基因序列成功插入载体；B: 质粒 A 测序结果Fig 2.1 A: Three sh-ASIC3 gene sequence was successfully inserted into the vector;B: Plasmid A sequencing results4.2 ASIC3 基因 mRNA 及蛋白相对表达量的变化RT-PCR 检测结果表明，sh-ASIC3 慢病毒感染组较 sh-EGFP 慢病毒感染组PC12、BV2、N2a 细胞中 mRNA 的转录水平明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。在 Western blotting 结果显示，sh-ASIC3 慢病毒感染组较 sh-EGFP 慢病毒感染组蛋白表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。(图 2.2）
、结痂等现象，患侧肢体活动出现明显受限，对侧肢体活动正常，空白对照假手术组小鼠生长情况及小鼠足底注射部位无明显变化，提示小鼠皮肤癌痛建立成功（如图 3.1）。 三组小鼠接种后，进食排便均无明显改变，一般情。小鼠接种前后隔天观察并记录小鼠接种侧瘤体变化情况及行为学自由行走评分。结果显示：小鼠接种前 CIP 组、C 组和 S 组小鼠行为学自由行走疼痛均为 0 分。接种后，C 组和 S 组小鼠行为学自由行走疼痛评分无统计学意P＞0.05）。CIP 组与其余两组相比，随着肿瘤大小的增长，小鼠行为学自由疼痛评分呈现逐渐增长的趋势，且从接种后 5 天起差异具有统计学意义（P.05）。（如表 1，图 3.2）
【参考文献】
本文编号：2858535
【学位单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R739.5;R-332
【部分图文】：
图 1 ASIC 存在于外周神经末梢&肿瘤与感觉神经元的联系Fig 1 ASIC exists in peripheral nerve endings & The connection between tumor and sensory neurons感性，但会降低机械感受器对有害刺激的敏感性[21]。有研究者认为外周致敏是骨癌疼痛的主要诱因，周围感觉神经通常受神经支配的组织的纤维被骨癌和癌症相关免疫细胞释放的产物激活和敏化，受影响的背根神经节（DRG）神经元表现出异位自发活动和过度兴奋，这部分导致严重的持续慢性疼痛[22,23]。位于疼痛感觉神经元胞体以及神经纤维膜表面的受体或离子通道是感知各种伤害性刺激的重要结构，因此，癌性疼痛的产生与相关受体或离子通道性状的改变密切相关。随着近年来癌性疼痛的研究逐渐增多，尤其是分子机制的研究，旨在为癌性疼痛的
图 2.1 A: 3 种 sh-ASIC3 基因序列成功插入载体；B: 质粒 A 测序结果Fig 2.1 A: Three sh-ASIC3 gene sequence was successfully inserted into the vector;B: Plasmid A sequencing results4.2 ASIC3 基因 mRNA 及蛋白相对表达量的变化RT-PCR 检测结果表明，sh-ASIC3 慢病毒感染组较 sh-EGFP 慢病毒感染组PC12、BV2、N2a 细胞中 mRNA 的转录水平明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。在 Western blotting 结果显示，sh-ASIC3 慢病毒感染组较 sh-EGFP 慢病毒感染组蛋白表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。(图 2.2）
、结痂等现象，患侧肢体活动出现明显受限，对侧肢体活动正常，空白对照假手术组小鼠生长情况及小鼠足底注射部位无明显变化，提示小鼠皮肤癌痛建立成功（如图 3.1）。 三组小鼠接种后，进食排便均无明显改变，一般情。小鼠接种前后隔天观察并记录小鼠接种侧瘤体变化情况及行为学自由行走评分。结果显示：小鼠接种前 CIP 组、C 组和 S 组小鼠行为学自由行走疼痛均为 0 分。接种后，C 组和 S 组小鼠行为学自由行走疼痛评分无统计学意P＞0.05）。CIP 组与其余两组相比，随着肿瘤大小的增长，小鼠行为学自由疼痛评分呈现逐渐增长的趋势，且从接种后 5 天起差异具有统计学意义（P.05）。（如表 1，图 3.2）
【参考文献】
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本文编号：2858535
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