泛素连接酶E6AP敲减及过表达稳转细胞株的构建与鉴定

发布时间：2020-10-27 20:45

　　 目的旨在筛选出能稳定敲减及过表达泛素连接酶E6AP的细胞株,在这两种情况下比较已知底物Arc的泛素化修饰区别,以期进一步阐明E6AP通过调控底物的泛素化进而影响底物下游功能的机理。方法从人胚肾293细胞中提取RNA再反转录成cDNA,以c DNA为模板通过PCR扩增得到E6AP目的条带,将E6AP基因克隆至p LVXIRES-mCherry质粒,构建过表达质粒;同时,合成可特异性结合E6AP mRNA的shRNA,并克隆至GIPZ质粒,构建敲减质粒。结果通过嘌呤霉素筛选得到敲减及过表达稳转细胞株,通过免疫共沉淀实验比较底物的泛素化修饰区别。结论成功构建E6AP敲减及过表达稳转细胞株,并能相应影响HEK-293细胞中底物Arc的泛素化修饰水平。
【部分图文】：

以人胚肾293细胞cDNA为模板进行PCR扩增得到的全长E6AP片段大小符合预期值(图1A)。构建好的质粒通过双酶切验证，可看到载体与目的基因条带分开，条带大小与预期一致(图1B)，测序结果显示质粒构建成功。2.2 瞬时转染shE6AP质粒至HEK-293细胞

药物筛选维持一个月后，通过比较不同组细胞株中E6AP表达情况，可发现sh E6AP2稳转细胞株对E6AP表达的抑制作用最强(图2D、2E)，故以此稳转细胞株进行后续研究。2.4 瞬时转染E6AP过表达质粒至HEK-293细胞

药物筛选维持一个月后，我们挑取6个细胞株通过western实验比较不同细胞株中E6AP表达情况，结果显示3个细胞株与对照组相比均能显著增强E6AP表达(图3D、3E)，其余3个细胞株与对照组相比E6AP表达量差别不大，我们猜测可能是由于E6AP过表达基因未能成功整合至细胞自身的基因组上，故而未能增强E6AP表达。将筛选成功的3个细胞株扩大培养后，进行后续研究。2.6 E6AP敲减及过表达稳转细胞株对底物Arc的泛素化影响(图4)
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本文编号：2859042