抗VEGF药物治疗机械性眼外伤及其机制的实验研究

发布时间：2020-11-01 04:41

　　 目的:本研究通过建立机械性眼外伤动物模型,评价玻璃体腔注射雷珠单抗和康柏西普对VEGF、PDGF、TGF-β和PAI-1的影响及其安全性,并分析其相关机制。方法:(1)取体重2-2.5KG,3-6月龄健康比利时兔95只随机分组,分为正常组(n=5)、开放性眼外伤(Open-globe Injury,OGI)组(n=15)、闭合性眼外伤(Closed-globe Injury,CGI)组(n=15)、开放性眼外伤雷珠单抗注射组(n=15)、开放性眼外伤康柏西普注射组(n=15)、闭合眼外伤雷珠单抗注射组(n=15)和闭合性眼外伤康柏西普注射组(n=15)。开放性眼外伤模型制作方法为用无菌15度穿刺刀于兔右眼颞上方角巩膜缘后6.0 mm刺入眼球内部,并沿该穿刺口平行角巩膜缘用眼科剪延长球壁切口至5.0 mm,0.5h后按照无菌原则缝合伤口,缝合后抗生素滴眼。闭合性眼外伤模型制作方法为应用液压颅脑损伤仪(Fluid percussion injury,FPI),设置打击锤角度为65°,正面击打于兔右眼角膜中心1次,伤后抗生素滴眼。(2)开放性眼外伤组和闭合性眼外伤组分别在外伤后7d、10d、14d抽取玻璃体0.1mL。外伤后药物注射组在外伤后0.5h、3d或7d玻璃体腔注射雷珠单抗0.25mg或康柏西普0.25mg,注药后7d抽取玻璃体0.1mL。(3)酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测各组玻璃体内VEGF、PDGF、TGF-β、PAI-1因子浓度。所有兔在外伤后28d处死用于做相关实验,采用HE染色观察各组兔视网膜的组织病理学改变,采用免疫荧光染色检测GFAP阳性的星形胶质细胞和Müller细胞显示视网膜增生情况。结果:(1)开放性眼外伤后注射雷珠单抗可显著降低玻璃体内PAI-1、VEGF、PDGF的浓度,在OGI后0.5h、3d或7d注射雷珠单抗,7d后其玻璃体内细胞因子浓度分别为:PAI-1:3.25±1.9 9 ng/ml、2.70±2.02 ng/ml、23.60±17.52 ng/ml;VEGF:9.47±20.95 pg/ml、22.77±9.98 pg/ml、16.12±18.58 pg/ml;PDGF:9.91±9.29pg/ml、3.97±6.26 pg/ml、12.09±16.78 pg/ml(P0.05)。TGF-β仅在外伤后在7d注射雷珠单抗显著降低,7d后其玻璃体内浓度为26.13±3.99 pg/ml(P0.05)。开放性眼外伤后注射康柏西普同样均可显著降低玻璃体内PAI-1、VEGF、PDGF的浓度,在OGI后0.5h、3d或7d注射康柏西普,7d后其玻璃体内细胞因子浓度分别为:PAI-1:6.13±4.34 ng/ml、2.19±0.58 ng/ml、3.76±1.079 ng/ml;VEGF:34.47±25.96 pg/ml、30.21±14.51 pg/ml、15.85±11.14 pg/ml;PDGF:8.97±11.76 pg/ml、6.63±8.17 pg/ml、8.97±8.12 pg/ml(P0.05)。TGF-β仅在OGI后7d注射康柏西普降低,7d后其玻璃体内浓度为246.76±56.38 pg/ml(P0.05),0.5h和3d注射康柏西普不能降低TGF-β的浓度。OGI后0.5h、3d或7d注射雷珠单抗或康柏西普,VEGF和PDGF浓度无显著差异;OGI后早期注射康柏西普可使PAI降低程度更大(3d注射vs.7d注射,P0.05);OGI后7d注射雷珠单抗较注射康柏西普更能显著降低TGF-β(P0.05)。(2)闭合性眼外伤后注射雷珠单抗可明显降低玻璃体内PAI-1、VEGF和PDGF的浓度,在CGI后0.5h、3d或7d注射雷珠单抗,7d后其玻璃体内细胞因子浓度分别为:PAI-1:15.76±10.17 ng/ml、11.3±5.46 ng/ml、4.98±4.76 ng/ml;VEGF:-0.76±10.12 pg/ml、-8.39±38.06 pg/ml、5.59±6.44 pg/ml;PDGF:-7.78±3.22 pg/ml、-7.61±6.42 pg/ml、-10.25±0.89 pg/ml(P0.05)。闭合性眼外伤后注射康柏西普也可明显降低玻璃体内PAI-1、VEGF和PDGF的浓度,在CGI后0.5h、3d或7d注射康柏西普,7d后其玻璃体内细胞因子浓度分别为:PAI-1:1.91±1.28 ng/ml、8.36±6.7 ng/ml、7.06±10.73 ng/ml;VEGF:-15.17±38.2 pg/ml、10.89±10.48 pg/ml、5.59±12.25 pg/ml;PDGF:-8.84±2.53 pg/ml、5.77±32.68 pg/ml、-3.38±4.93 pg/ml(P0.05)。CGI后0.5h、3d或7d注射雷珠单抗或康柏西普,VEGF和TGF-β浓度无显著差异;CGI后0.5h注射康柏西普较注射雷珠单抗更能显著降低PAI(P0.05);CGI后7d注射雷珠单抗比注射康柏西普更能显著降低PDGF(P0.05);CGI后注射雷珠单抗或康柏西普不能降低TGF-β浓度。(3)HE染色显示开放性眼外伤组视网膜组织厚度变厚,神经节细胞层疏松,各层结构排列紊乱;闭合性眼外伤组视网膜厚度减少,神经节细胞层变薄,视网膜各层结构不清。开放性眼外伤后0.5h注射雷珠单抗组或康柏西普视网膜各层均趋于正常,细胞排列较规则,视网膜纤维增殖减少;闭合性眼外伤后0.5h注射雷珠单抗或康柏西普视网膜结构均趋于正常,神经节细胞排列较规则。(4)B超结果显示开放性眼外伤4W后视网膜伤口部位有局限性强回声;开放性眼外伤后玻璃体腔注射雷珠单抗或康柏西普4W后玻璃体腔内未见强回声。结合眼球解剖可见开放性眼外伤后注射雷珠单抗或康柏西普可抑制伤口处视网膜增殖膜形成。(5)免疫荧光显示开放性眼外伤后视网膜中GFAP阳性的星形胶质细胞和Müller细胞增生,轴突增长,表现在全视网膜层,注射雷珠单抗后其表达减少。结论:(1)机械性眼外伤后眼内注射雷珠单抗或康柏西普,有抑制视网膜增殖的趋势。(2)开放性眼外伤早期玻璃体腔注射雷珠单抗或康柏西普可预防增生病变,闭合性眼外伤玻璃体腔注射雷珠单抗或康柏西普有增加病变风险,需进一步研究和探讨机制。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R779.1;R-332
【部分图文】：

图 7.A：空白组视网膜各层结构清晰，细胞排列紧密，形态完整。B：与空白组相比（图 7.A），开放性眼外伤组视网膜组织厚度变厚，神经节细胞层疏松，各层结构排列紊乱，细胞排列疏松；C：与开放性眼外伤组相比（图 7.B），开放性眼外伤后 0.5h 注射雷珠单抗组视网膜各层趋于正常，细胞排列较规则，视网膜纤维增殖减少；D：开放性眼外伤后 0.5h 注射康柏西普组视网膜结构同样趋于正常，神经节细胞从排列相对规则，视网膜纤维增殖减少；E：空白组视网膜各层结构清晰，细胞排列紧密，形态完整；F：闭合性眼外伤组可见视网膜厚度减少，神经节细胞层变薄，视网膜各层结构不清，细胞排列紊乱。G：与闭合性眼外伤组相比，闭合性眼外伤后 0.5h 注射雷珠单抗后视网膜组织增厚，结构趋于正常，细胞排列相对规则；H：闭合性眼外伤后 0.5h 注射康柏西普视网膜结构趋于正常，细胞排列较规则。（×200，n=3，比例尺为 50 μm）2.4 开放性眼外伤后视网膜增生情况变化兔眼球 B 超结果如图 8.所示，空白对照组视网膜平伏在位，玻璃体清（图8A）；开放性眼外伤 4W 后伤口部位视网膜局限性强回声（见箭头所示），玻璃

图 8. 兔眼球 B 超如图 A-D 所示；A：空白对照组 B 超示视网膜平伏在位，玻璃体清；B：开放性眼外伤 4W 后伤口部位视网膜局限性强回声（见箭头所示），玻璃体混浊；C:开放性眼外伤后玻璃体腔注射雷珠单抗 4W 后玻璃体腔内高回声消失，玻璃体清; D: 开放性眼外伤后玻璃体腔注射雷珠单抗 4W 后玻璃体腔内高回声消失，玻璃体清。 兔眼球解剖结果如图 E-H 所示；E: 开放性眼外伤后 4W眼球解剖可见空白对照组视网膜无增殖，玻璃体清；F：开放性眼外伤后伤口处视网膜增殖明显（ 示伤口部位，示增殖膜），玻璃体腔混浊；G：开放性眼外伤后注射雷珠单抗后可见伤口处视网膜增殖减低，玻璃体相对较清；H：开放性眼外伤后注射康柏西普后可见伤口处视网膜增殖减少，玻璃体相对较清。2.5 开放性眼外伤后视网膜 GFAP 的变化视网膜免疫荧光染色结果如图 9 所示（×200，n=3），空白对照组兔视网膜核层排列整齐，GFAP 阳性的星形胶质细胞和 Muller 细胞弱表达，主要分布在神经节细胞层、内丛状层、内核层、外丛状层和外核层（图 9A-C）；开放性眼外伤组兔视网膜核层排列尚可，视网膜中 GFAP 阳性的星形胶质细胞呈强阳性表达

19图 8. 兔视网膜切片 GFAP 阳性的星形胶质细胞表达。Control 组：空白对照组，核层排列整齐，GFAP 阳性的星形胶质细胞主要在神经节细胞层，内丛状层、内核层、外丛状层和外核层；OGI 组：开放伤组显示视网膜核层尚可，GFAP 表达星形胶质细胞和 Müller 细胞胞体增多，轴突增长，表现在全视网膜层；OGI 后注射雷珠单抗组：该组视网膜核层排列相对整齐，GFAP 表达较外伤组明显减少。（GCL，神经节细胞层；IPL，内丛状层；INL，内核层；OPL，外丛状层；ONL，外核层； IS / OS，感光细胞层的内段/外段；×200，n=3，比例尺为 50 μm）3 讨论机械性眼外伤是导致视力下降或失明的主要原因之一，它不仅造成眼球结构的损伤，还可发生一些严重的并发症。外伤性增生性玻璃体视网膜病变
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本文编号：2865027