结核分枝杆菌Cas2（Rv2816c）在胁迫应答及胞内存活中的作用与分子机理

发布时间：2017-04-05 15:06

  本文关键词：结核分枝杆菌Cas2（Rv2816c）在胁迫应答及胞内存活中的作用与分子机理，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)感染引起的种严重威胁人类健康的疾病,它仍然是中国乃至世界上威胁人类健康的重要传染病。世界人口中大约有1/3是结核分枝杆菌的潜伏感染者,每年死于结核病的人大约有130万[1]。导致结核病难以攻克的主要原因是多重耐药菌和广泛耐药菌的出现以及与HIV共感染。因此,需要对结核病的致病菌——结核分枝杆菌进行更加深入的基础研究。结核分枝杆菌在体外生长的过程中面临着病毒——噬菌体的威胁,噬菌体在地球上几乎无处不在。面对噬菌体的威胁,细菌逐渐进化出了一系列的抗噬菌体机制,例如：限制性内切酶、流产感染[2],以及clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)系统。CRISPR系统是一个最近几年发现的细菌抗噬菌体机制,它存在于90%的古生菌以及40%的细菌基因组中[3,4],它为细菌和古生菌提供了一套获得性噬菌体抵抗机制。CRISPR系统含有由一系列被非重复的间隔序列分散的短的重复序列。此外,它还包含一个前导序列和周围CRISPR-相关的基因(CAS)[5]。不同的Cas蛋白的功能各不相同,例如核糖核酸酶、解旋酶、聚合酶等。最近有研究证明,CRISP R位点具有基因表达调控的功能[6]。Francisella novicida的Cas9蛋白能够调控编码脂蛋白的基因FTN_1103的表达[7]。CRISPR中与自身基因组中的DNA序列同源的间区被报道与自身免疫及基因表达调控有关[8,9]。Cas2已经被报道是一个在间区获得过程中起重要作用的保守的RNA核酸内切酶[10-12],它广泛分布于所有含有CRISPR序列的微生物基因组中[9,13,14]。Cas2对于L. pneumophila侵染其宿主,Hartmannella 和 Acanthamoeba以及逃避巨噬细胞免疫非常重要[15]。结核分枝杆菌基因组中具有两个串联的CRISPR结构,并且它们周围有9个编码CRISPR相关的蛋白的基因,其中包括编码Cas2的Rv2816c[12]。当用抑制代谢的抑制剂,例如抗生素、引起压力的试剂等处理结核分枝杆菌后,Rv2816c的转录水平会发生变化[16]。因此我们推测Rv2816c可能涉及到结核分枝杆菌的抗压力反应以及抗生素抗性。本文通过将分枝杆菌Cas2的氨基酸序列与之前研究过的硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的Cas2氨基酸序列进行比对,找到分枝杆菌Cas2的二级结构元件以及它的催化活性位点,且发现Cas2在致病分枝杆菌中是非常保守的。我们用耻垢分枝杆菌作为模式菌株构建了过表达结核分枝杆菌Cas2 (Rv2816c)的重组耻垢分枝杆菌M. smegmatis-pALACE-Rv2816c。对 M. smegmatis-pALACE-Rv2816c表型进行了观察,并研究了Cas2对耻垢分枝杆菌胞外压力反应以及在巨噬细胞内存活率的影响。我们发现Cas2的表达改变了耻垢分枝杆菌的生长速率、单菌落形态、滑动能力以及生物膜的形成能力,这些表面形态的改变可能与Cas2引起的耻垢分枝杆菌细胞壁脂质成分的改变有关；此外,我们发现了Cas2引起的耻垢分枝杆菌压力反应的改变与SigB、SigE及SigH表达水平的改变有关。这三个Sigma因子涉及到分枝杆菌的压力反应以及毒力。我们还发现Cas2降低了M.smegmatis-pALACE-Rv2816c在巨噬细胞中的存活率,并伴随着宿主细胞因子IL-6和IL-10的转录水平降低。我们的工作为Cas2功能的研究提供了新的方向。
【关键词】：结核分枝杆菌 CRISPR系统 Cas2 基因表达调控 压力反应
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R378.911
【目录】：

• 摘要9-11
• Abstract11-13
• 第1章 综述13-21
• 1.1 引言13
• 1.2 CRISPR概述13
• 1.3 CRISPR/Cas系统结构组成13-14
• 1.4 CRISPR/Cas系统的主要类型14
• 1.5 CRISPR/Cas系统的功能14-16
• 1.5.1 适应阶段15
• 1.5.2 表达15
• 1.5.3 干扰15-16
• 1.6 CRISPR/Cas系统的应用16
• 1.6.1 Cas蛋白被用于基因组编辑16
• 1.6.2 Cas蛋白应用于转录调控16
• 1.7 CRISR与噬菌体的共进化16-17
• 1.8 CRISPR/Cas关于基因调控的研究17-19
• 1.8.1 调控病原菌毒力17-18
• 1.8.2 反义CRISPR RNA的调控作用18
• 1.8.3 基因调控可能的机制18-19
• 1.9 结核分枝杆菌中的CRISPR19
• 1.10 展望19-21
• 第2章 前言21-23
• 第3章 实验材料和方法23-37
• 3.1 实验材料23-26
• 3.1.1 菌株、质粒和细胞23
• 3.1.2 主要试剂和材料23-24
• 3.1.3 培养基及主要试剂的配置24-25
• 3.1.4 主要仪器和设备25-26
• 3.2 实验方法26-37
• 3.2.1 结核分枝杆菌H37Rv基因组的提取：CTAB法26
• 3.2.2 结核分枝杆菌Rv2816c基因PCR引物的设计与合成26
• 3.2.3 结核分枝杆菌Rv2816c基因扩增26
• 3.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化(热激法)26-27
• 3.2.5 Rv2816c基因的TA克隆27
• 3.2.6 pALACE-Rv2816c穿梭载体构建27-28
• 3.2.7 耻垢分枝杆菌感受态的制备及电转化28-29
• 3.2.8 重组质粒在耻垢分枝杆菌中的表达及验证29-30
• 3.2.9 菌落形态观察30
• 3.2.10 生长曲线的测定30
• 3.2.11 滑动实验30
• 3.2.12 耻垢分枝杆菌生物膜培养方法30
• 3.2.13 耻垢分枝杆菌脂肪酸分析30-31
• 3.2.14 氧化压力的耐受性检测31
• 3.2.15 SDS耐受性检测31
• 3.2.16 酸耐受性检测31-32
• 3.2.17 Trizol法提取耻垢分枝杆菌总RNA32
• 3.2.18 Rv2816c对相关基因转录水平的影响32-34
• 3.2.19 耻垢分枝杆菌侵染巨噬细胞后存活率检测34-35
• 3.2.20 巨噬细胞被重组耻垢分枝杆菌侵染后总RNA的提取35
• 3.2.21 定量RT-PCR检测M semgmatis-pALACE-Rv2816c侵染THP-1巨噬细胞后相关细胞因子转录水平35-37
• 第4章 结果与分析37-51
• 4.1 Cas2在致病分枝杆菌中是保守蛋白37
• 4.2 Rv2816c基因的PCR扩增及鉴定37-38
• 4.3 构建M. smegmatis-pALACE-Rv2816c重组耻垢分枝杆菌38-39
• 4.4 Rv2816c基因在重组耻垢分枝杆菌中表达39
• 4.5 过表达Rv2816c基因使耻垢分枝杆菌的生长速度加快39-40
• 4.6 Rv2816c基因的过表达使耻垢分枝杆菌单菌落形态发生改变40
• 4.7 重组分枝杆菌的滑动能力降低40-41
• 4.8 过表达Rv2816c基因影响耻垢分枝杆菌生物膜的形成41-42
• 4.9 过表达Rv2816c基因对耻垢分枝杆菌中的脂质成分无太大影响42
• 4.10 过表达Rv2816c基因使耻垢分枝杆菌对SDS敏感42-43
• 4.11 过表达Rv2816c基因使耻垢分枝杆菌对氧化压力更敏感43-44
• 4.12 M. smegmatis-pALACE-Rv2816c对压力条件的敏感由Sigma因子介导44-45
• 4.13 过表达Rv2816c基因使耻垢分枝杆菌对氧氟沙星和诺氟沙星敏感且是由活性氧介导的45-46
• 4.14 过表达Rv2816c基因使耻垢分枝杆菌对酸性条件敏感46-47
• 4.15 过表达Rv2816c基因降低耻垢分枝杆菌在巨噬细胞中的存活率47-48
• 4.16 Rv2816c基因的表达降低了耻垢分枝杆菌诱导的THP-1细胞因子的分泌48-51
• 第5章 结论与展望51-53
• 5.1 实验结论与分析51-52
• 5.2 展望52-53
• 参考文献53-61
• 致谢61-63
• 在学校期间所发表的文章63

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1 黄琴琴;结核分枝杆菌Cas2（Rv2816c）在胁迫应答及胞内存活中的作用与分子机理[D];西南大学;2015年

  本文关键词：结核分枝杆菌Cas2（Rv2816c）在胁迫应答及胞内存活中的作用与分子机理，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：287192