研究背景:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,金葡菌)是一种流行广泛、严重危害人类健康的致病菌,特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Meticillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA),是具有强致病性、多重耐药的“超级细菌”,已成为临床上治疗的难题,严重威胁人类健康。2017年世界卫生组织(WHO)列出了“12类最危险的‘超级细菌’”,金黄色葡萄球菌被列为“高度”优先。美国每年约有9.4万人严重感染MRSA,由此导致的死亡人数约为1.9万。我国MRSA感染发病率较高,“全国细菌耐药检测网”调查显示,内地医院革兰氏阳性菌中金葡菌的临床分离率占首位,院内MRSA感染发病率约为8%,每年由MRSA感染造成的直接经济损失高达150亿元。面对金葡菌耐药性的不断增加,免疫防治策略的相关研究有待加强,研发新的、有效的且不易产生耐药的免疫防治药物,如治疗性抗体等,对于有效控制金葡菌感染、减少医院感染死亡率,延缓耐药发展,具有重要的意义。当前,还没有金葡菌的抗体药物应用于临床,在国外开展的金葡菌治疗性抗体临床研究中,Inhibitex公司的INH-A21以表面凝聚因子A(ClfA)为靶点,Ⅲ期临床试验结果显示实验组与安慰剂组比较没有显著差异;Nabi公司以金葡菌荚膜为靶点的人免疫球蛋白在II期临床试验后也宣布失败。而正在开展的金葡菌疫苗临床试验,如Pfizer公司的SA4Ag和GSK公司的GSK2392103A,其主要抗原成分均包含了四种金葡菌关键抗原。金葡菌毒力因子较多,致病因素复杂,单一的抗原靶点难以形成有效的保护,因此,基于金葡菌免疫防治的大量临床前及临床试验研究结果,并总结相关研究失败原因,金葡菌治疗性抗体药物应该能够涵盖多个关键毒力因子,才能形成有效的保护。本课题组在前期金葡菌免疫防治研究中,利用反向疫苗学技术并结合大量动物免疫保护实验,从金葡菌全基因组的2742个开放阅读框中筛选出了5种免疫原性好、保守性高的免疫优势抗原:α-溶血素(Hla)、铁离子表面决定蛋白B(IsdB)、金葡菌蛋白A(SpA)、肠毒素B(SEB)及锰离子转运蛋白C(MntC),单个抗原免疫后的小鼠对金葡菌感染均具有一定的保护效果。以相应去毒化突变的抗原为主要成分研发了重组金葡菌疫苗,在小鼠、大鼠金葡菌菌血症、肺炎感染及骨折感染等致死性模型中均具有良好的免疫保护作用,并顺利完成了Ⅰ期临床试验。研究目的:以重组金葡菌疫苗Ⅰ期临床试验受试者外周血浆细胞为抗体来源,利用单个浆细胞PCR等技术构建抗体表达载体,将表达载体瞬时转染293T细胞,ELISA检测筛选该细胞中分泌的抗体,并将筛选的抗体毫克(mg)级表达,分别从结合活性、亲和力及中和活性进行体外评价,建立小鼠α-溶血素致死模型及MRSA252菌血症致死模型评价单克隆抗体体内免疫保护效果。为金葡菌治疗性单克隆抗体药物的研发奠定坚实的实验基础。研究方法:1.将突变后的5种金葡菌保护性抗原mHla、IsdB、SpA5、mSEB及MntC包被,对Ⅰ期临床试验受试者外周血血清进行ELISA检测,筛选对5种保护性抗原均有高效价抗体的血清样本,将高效价抗体血清对应的外周血单个核细胞(PBMC)用CD19、CD27及CD38等浆细胞表面标志物荧光标记抗体进行标记,利用流式细胞术将PBMC中CD19~+、CD27~+及CD38~+,且CD3~-、CD14~-的细胞群分选成单个浆细胞。2.利用基因工程技术,以裂解后的单个浆细胞中mRNA为模板进行RT PCR,扩增出抗体可变区基因的cDNA,而后以cDNA为模板,用特异性引物经过两轮PCR,扩增出抗体可变区基因。将抗体可变区基因与启动子、恒定区基因及多聚A尾用重叠PCR进行连接,构建抗体表达载体并转染293T细胞,以5种保护性抗原对细胞培养上清进行ELISA筛选。将筛选到的单克隆抗体线性表达载体克隆到pcDNA3.3质粒上,并瞬时转染293T细胞,纯化细胞培养上清中的单克隆抗体。3.以金葡菌的5种抗原蛋白对不同浓度的单克隆抗体进行ELISA检测,评价单克隆抗体与抗原的结合活性。将wtHla与Hla单克隆抗体共孵育后分别作用于兔红细胞及A549细胞,检测单克隆抗体对wtHla溶血及A549细胞杀伤作用的阻断能力,评价其中和活性。4.建立wtHla腹腔攻毒小鼠致死模型及尾静脉攻毒小鼠致死模型,将Hla单克隆抗体与wtHla体外共孵育后再攻毒,评价Hla单克隆抗体对wtHla攻毒小鼠的免疫保护作用。建立MRSA252小鼠菌血症感染致死模型,在致死剂量攻毒后2h或攻毒前24小时尾静脉注射抗体,评价抗体对小鼠MRSA252菌血症感染致死模型的免疫保护效果。研究结果:1.ELISA筛选了52份重组金葡菌疫苗Ⅰ期临床受试者外周血血清,得到了8份对5种保护性抗原均有高效价抗体的血清样本,三次免疫后血清特异性抗体效价为免疫前的16-256倍,将该8份高效价抗体血清对应的PBMC进行荧光标记及流式细胞术的分选,共分选到1120个浆细胞。2.利用浆细胞中mRNA为模板,进行RT PCR后再进行PCR,将PCR产物进行基因测序及抗体序列比对,得到了461对抗体重链及轻链可变区基因,将重链、轻链可变区基因分别通过重叠PCR装配成线性表达载体并转染表达,ELISA筛选得到了39个阳性单克隆抗体,并进行抗体亚型及重链、轻链基因亚型的分析,39个抗体中,包含15个IgG1、3个IgG2、14个IgA及7个IgM亚型;抗体重链可变区基因由5个VH1、3个VH2、23个VH3、9个VH4及1个VH5亚型组成;抗体轻链可变区基因包括11个VK1、4个VK2、3个VK3、1个VK4、8个VL1、6个VL2、4个VL3、1个VL9及1个VL10亚型。对其中10株单克隆抗体进行了1mg以上的表达。3.ELISA检测10株单克隆抗体的结合活性结果表明,Hla单克隆抗体M0411、IsdB单克隆抗体M0318、SpA5单克隆抗体M0659、M0662、SEB单克隆抗体M0283及MntC单克隆抗体M0686的结合活性较好,当抗体浓度增加时,在450nm处的吸光度值也随之增高。Western-blot结果证明,除SpA5单克隆抗体M0662识别构象表位外,其余9株单克隆抗体均识别线性表位。wtHla溶血阻断实验及wtHla的A549细胞杀伤作用阻断实验表明,M0411具有很好的中和作用,能够中和wtHla的体外毒性。4.分别以4μg/只、14μg/只的攻毒剂量,建立了wtHla尾静脉、腹腔攻毒致死模型(死亡率≥90%)。在腹腔攻毒致死模型中,20μg/只的M0411具有100%的保护效果;在尾静脉攻毒致死模型中,10μg/只及5μg/只的M0411均具有100%的保护效果。以每只小鼠9x10~8CFU的MRSA252建立了菌血症致死感染模型(死亡率≥90%),在该模型中,每只小鼠在攻毒前24h注射20mg/kg体重的M0411,小鼠生存率达到100%,注射10mg/kg体重的M0411,小鼠生存率则为90%。每只小鼠在攻毒后2h注射10mg/kg体重的M0411,则没有明显的保护效果,生存率与对照组相比没有统计学差异。研究结论:1.通过ELISA筛选出了8份高抗体效价的血清样本,并从对应PBMC中分选了1120个浆细胞。2.通过PCR扩增、基因测序及序列比对,得到了461对抗体重链、轻链可变区基因,并构建了线性表达载体,从表达载体转染细胞上清中筛选到了39株单克隆抗体,并毫克(mg)级表达纯化了其中10株单克隆抗体,抗体纯度较高。3.结合活性检测结果表明,M0283、M0318、M0411、M0659、M0662及M0686的结合活性较好。Western-blot结果表明,M0662识别构象表位,其余11株单克隆抗体均识别线性表位。4.体外中和实验结果表明,M0411能够阻断wtHla对兔红细胞的溶血及对A549细胞的杀伤作用,具有良好的中和活性。5.小鼠体内免疫保护实验结果表明,M0411能够阻断wtHla对小鼠的致死作用,同时,M0411对MRSA252攻毒小鼠的免疫保护率达到100%。
【学位单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R392
【部分图文】：
图 2-1. 对 5 种抗原蛋白均有高效价抗体的受试者血清抗体效价增加倍数Figure 2-1. Antibody titers increasing folds of serum samples with high changes towards five antigens表 2-8. 抗体筛选优选次序2.3.2 流式细胞术分选出 1120 个浆细胞
图 2-2. 单克隆抗体可变区基因 DNA 电泳Fig 2-2. The DNA electrophoresis of mAb variable region gene. The heavy chain variable region(a);The kappa chain variable region(b); The lambda chain variable region(c)2.3.3 ELISA 筛选 293T 细胞培养上清得到 39 个单克隆抗体通过微量转染试剂盒将 461 对线性表达载体转染 293T 细胞，在低血清培养基中培养 72 小时，收集细胞培养上清，将金葡菌的 5 个保护性抗原 mHla、IsdB、SpA5、SEB 及 MntC 包被在酶标板上，用 ELISA 的方法对细胞培养上清进行检测，以阴性对照吸光度平均值的 2.1 倍作为 Cut-off 值，即阳性判定值，判定上清中是否有相应抗体，共筛选到 39 个阳性抗体，450nm 波长处的吸光度值见图 2-3e，这 39 个抗体分别来源于 4 份血清样本，其在各血清样本中的分布见图 2-3（a-d）。其中 mHla 抗体的 M0398、M0399、M0411、M0699，IsdB 抗体的 M0318、M0400，SpA5 抗体的 M0659、M0662、M0676 及 M0715，mSEB 抗体的 M0313、M0487，以及 MntC 抗体的 M0686，450nm
图 2-3. 各受试者血样流式细胞术分选浆细胞数及单克隆抗体筛选 Plasma sorting by flow cytometry of blood samples and mAbs sorting. Single pnd positive antibodies of V7-1 (a) ; V7-127 (b); V7-132 (c); V7-135 (d); mAbs slinear expression cassettes transfected- 293T cells supernatant (e) 单克隆抗体的大量表达及纯度鉴定线性表达载体转染293T细胞培养上清的ELISA筛选结果，对M030699、M0318、M0462、M0659、M0662、M0283 及 M0686 这 1克隆抗体优先进行了 mg 级的转染表达（M0400、M0313 及 M048后续克隆质粒暂未成功，暂时未大量表达），其表达量见表 2-9。同隆抗体进行了鉴定，应用蛋白 SDS-PAGE 凝胶分别进行还原性、非用以鉴定抗体的纯度及抗体的重链、轻链，非还原性电泳结果证明载体瞬时转染 293T 细胞，收集细胞培养上清并纯化得到了纯度较>90%），如图 2-4a；还原性电泳结果表明（图 2-4b），纯化的得到
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