肠道病毒71型2A蛋白酶通过切割宿主蛋白泛素特异性蛋白酶4促进病毒的复制

发布时间：2020-11-11 23:43

　　 目的探讨肠道病毒71型(EV71)2A蛋白酶与宿主蛋白泛素特异性蛋白酶4(USP4)在EV71感染中的作用。方法实时荧光定量PCR检测EV71感染人横纹肌肉瘤细胞(RD)后USP4 mRNA表达水平,western blot检测VP1及USP4蛋白;通过敲减宿主细胞USP4,观察VP1 mRNA的表达和病毒滴度水平;通过过表达2A蛋白酶,研究宿主细胞USP4蛋白的切割原因。结果荧光定量PCR结果表明,EV71感染8 h时USP4 mRNA的表达水平开始降低(0 h、8 h分别为1.03±0.04和0.83±0.02,t=4.50,P0.05);western blot结果表明,EV71感染8 h时USP4的蛋白质表达水平降低(0 h、8 h分别为1.25±0.01和0.51±0.02,t=57.32,P0.05)并出现切割条带;敲除宿主细胞USP4 8 h后,与对照组(1.48±0.08)相比,实验组VP1 mRNA表达水平(3.66±0.08)明显升高(t=17.51,P0.05);病毒滴度检测结果发现,与对照组病毒滴度[(8.20±0.17)×10~5 PFU/mL]比较,siRNA1敲除组病毒滴度[(10.55±0.29)×10~5 PFU/mL]升高,差异有统计学意义(t=6.98,P0.05)。过表达2A蛋白酶,宿主蛋白USP4出现切割条带。结论 USP4参与抗病毒免疫反应,可能正向调节抗病毒信号通路;EV71可通过2A蛋白酶切割宿主细胞蛋白USP4从而逃逸免疫应答,促进病毒的复制。
【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 抗体、病毒和细胞来源
    1.2 主要试剂与仪器
    1.3 空斑试验检测病毒滴度
    1.4 EV71病毒感染RD细胞
    1.5 实时荧光定量PCR
    1.6 western blot
    1.7 细胞转染试验
    1.8 统计学分析
2 结果
    2.1 病毒滴度的检测
    2.2 EV71感染RD细胞后USP4的表达情况
        2.2.1 EV71感染RD细胞后USP4 mRNA表达水平
        2.2.2 EV71感染RD细胞后USP4和VP1蛋白质表达水平
    2.3 敲减USP4后USP4、VP1 mRNA表达水平及病毒滴度变化
        2.3.1 USP4敲除后USP4 mRNA表达水平
        2.3.2 USP4 siRNA1敲除组和对照组中VP1 mRNA表达水平
        2.3.3 空斑实验检测病毒滴度
    2.4 EV71中的2A蛋白酶切割细胞中USP4蛋白
3 讨论

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